Клеточный цикл

1. Рост лимфоцитов может быть стимулирован митогенами (разд. 6.3).

2. Инкубированные без сыворотки клетки могут быть стимулированы добавлением сыворотки (Burk, 1970; разд. 11.6).

3. Клетки, прекратившие экспоненциальный рост и достигшие стационарной фазы вследствие ограничения поверхности, на которой они росли, могут быть стимулированы пересевом (Stoker, 1972; разд. 11.5).

⁷ Однако даже в популяции нерастущих клеток небольшое количество клеток способно к синтезу ДНК и делению. Можно думать, что хотя большая часть клеток находится в фазе GO, их малая часть стимулирована к пролиферации. В связи с этим возникает вопрос, зависит ли для данной клетки вероятность выхода из фазы GO и вступления в цикл от продолжительности времени, прошедшего после предыдущего деления, или же все клетки в фазе GO обладают равной вероятностью вступления в цикл? Последняя возможность наиболее убедительно обосно-"вана в работах Смита и Мартина (Smith, Martin, 1973, 1974). Фазы клеточного цикла S, G2, М и часть фазы G1 Смит и Мартин рассматривают как единую фазу, получившую название фазы В. Предполагалось, что для каждого данного типа клеток продолжительность фазы В фиксирована в узких пределах. Вскоре после деления клетки попадают в состояние А, в котором не происходит продвижения клеток по циклу. Клетка может оставаться в состоянии А в течение неопределенного промежутка времени, причем всегда имеется фиксированная вероятность (Р) перехода клетки в фазу В при постоянных внешних условиях. Смит и Мартин высказали предположение о том, что изменение этой вероятности перехода является главным фактором контроля пролиферации клеток.

В соответствии с моделью Смита и Мартина относительное количество клеток, остающихся в интерфазе (а), должно экспоненциально снижаться при увеличении возраста клеток, отсчитываемого с момента времени 7в после митоза. Следовательно, полулогарифмический график зависимости а от возраста клеток после митоза должен представлять собой прямую линию после лаг-периода, равного Гв. Как видно из рис. 10.4, экспериментальные данные подтверждают эту модель. Начальные изгибы внутрь перед линейными участками обусловлены вариабельностью Тв-

Существует другая модель, предсказывающая, что увеличение возраста клеток сопровождается увеличением вероятности деления, и на полулогарифмическом графике зависимости а от возраста это должно выражаться в постоянном изгибе кривой

внутрь. На практике различить эти две возможности очень трудно и вопрос о правильности той или иной модели контроля клеточной пролиферации до настоящего времени нельзя считать решенным (Baserga, 1978).

Инкубация лишенных сыворотки (разд. 11.6) клеток ЗТЗ с сывороткой в течение увеличивающегося промежутка времени приводит к увеличению числа клеток,- стимулированных к вступлению в фазу S. Существует точка зрения (Brooks, 1976) о том, что сыворотка определяет скорость вступления клеток в цикл благодаря созданию внешних условий, благоприятст-^ вующих высокой вероятности перехода. Для достижения этого увеличения вероятности требуется 14-часовой лаг-период, предшествующий вступлению клетки в фазу S. При удалении сыворотки вероятность вступления клеток в фазу В снижается, в связи с чем количество клеток, вступающих в фазу S, резко падает в течение 3—5 ч.

Это говорит о том, что этап, на котором может произойти вхождение клеток в цикл, отстоит от начала фазы S не более чем на 5 ч.

Смит и Мартин (Smith, Martin, 1974) добавляли 3 мМ гид-роксимочевину (ингибитор синтеза ДНК; разд. 11.8.4) к обработанным сывороткой клеткам как раз перед тем, когда клетки должны были вступить в фазу S. Через 6 ч после удаления ингибитора клетки вступали в фазу S, но не все одновременно; скорость их вступления в фазу зависела от концентрации сыворотки. По мнению авторов, это свидетельствовало о постоянной зависимости вероятности перехода и указывало на то, что клетки в присутствии гидроксимочевины задерживаются в состоянии А и этап перехода локализован на границе фаз G1 и S.

Традиционная модель клеточного цикла объясняет разницу времен генерации между клетками в популяции как результат суммирования незначительных различий в продолжительности большого числа этапов, требующихся для прохождения клетки от одного деления до другого. В модели Смита и Мартина (Smith, Martin, 1973) такие различия также имеют место и обусловливают неоднородность длины фазы В, но главный' вклад в различие времен генерации между клетками, согласно

Рис. 10.4. Распределение времен генерации различных типов клеток в культуре. Относительное число клеток (о), остающихся в интерфазе в различные моменты времени после деления, определяли для различных клеток с помощью цейтра-ферной киносъемки, а — саркома крысы, б — клетки HeLa S3, в — фибробласты мыши, г — клетки L5, д — клетки HeLa. [Перепечатано с любезного разрешения авторов (Smith, Martin, 1973) и издателей.]

их модели, вносят различия в продолжительности времени, проводимого клетками в состоянии А. Минор и Смит (Minor, Smith, 1974) показали, что различия в продолжительности фазы В между сестринскими клетками минимальны. Они обнаружили строгую корреляцию между межмитотическими временами дочерних клеток и общей вариабельностью времен генерации в популяции.

Маленькие и большие клетки из покоящейся культуры разделяли с помощью клеточного сортировщика с флуоресцентной активацией (разд. 10.7.5) и .измеряли продолжительность их клеточного цикла (Shields et al., 1978). Клетки обоих размеров обладали одинаковой вероятностью выхода из состояния А, но у более мелких клеток G1-часть фазы В длилась дольше, чем у более крупных клеток. Эти результаты проще интерпретировать в рамках модели Смита и Мартина, чем в рамках традиционной модели с фазой GO.

10.5. Распределение клеток по циклу

На каждую клетку, вступающую в митоз в конце клеточного цикла, приходится две клетки, входящие в следующий цикл. Это означает, что распределение клеток по фазам цикла неравномерно и на стадии экспоненциального роста в культуре преобладают молодые клетки.

В идеальной ситуации все клетки популяции имеют одинаковое время генерации, описываемое функцией распределения

f й=ЦгЧ

где k — константа роста, по — число клеток в момент времени нуль и t — время, выраженное в долях времени генерации, т. е. изменяющееся от 0 до 1.

Это выражение может быть приведено к основанию 2:

/(0 = *о2-<.

Таково идеальное распределение клеток вдоль клеточного цикла, показанное прямой линией на рис. 10.5 (Engleberg, 1961; Kubitschek, 1966).

Практически из-за вариабельности времени генерации ситуация более точно отражается пунктирной линией (рис. 10.5) (Sisken, Morasca, 1965).

Если не все клетки имеют одно и то же время генерации, то время, необходимое для удвоения числа клеток (7в), оказывается несколько ниже, чем время генерации (Т). И, с другой стороны, если не все клетки популяции делятся, т. е. если про-лиферативный пул ниже 1 (см. ниже), то 7Ъ будет больше, чем Т.

Количество клеток в начале фазы G1 будет вдвое выше,

Рис. 10.5. Распределение экспоненциально растущих клеток в клеточном цикле. Теоретическое распределение экспоненциально растущих клеток в клеточном цикле показано сплошной линией. Однако поскольку продолжительность клеточного цикла у индивидуальных клеток несколько варьирует, то реальное распределение более точно выражается пунктирной линией. Сразу после деления клетки имеют нулевой возраст, а ко времени следующего митоза их возраст становится равным Т. Положение фаз Gl, S и G2 соответствует таковому для типичной клетки. '[Перепечатано с любезного разрешения автора (Cleaver,

1967) .Q

чем в конце фазы G2. Такие же, но менее выраженные различия существуют между числом клеток в начале и в конце фазы S. Более того, относительное число клеток в фазе S зависит не только от относительной продолжительности фазы S и от времени генерации, но также и от положения фазы S в клеточном цикле (см., однако, «пролиферативный пул», ниже). Следовательно, неверным будет не только утверждение о том, что если 30% клеток находится в фазе S (индекс метки ИМ= =0,3), то продолжительность фазы S (tS) составляет 30%' времени генерации, но даже зависимость

ИМ = 1п-у-

также является неверной. Чтобы связать tS с ИМ, следует выяснить положение фазы S внутри клеточного цикла, соотнеся его с Г и Ю2. В конечном счете мы придем к выражению

ИМ=|аф£— Iny-1 J ехр «32 In ~

(Cleaver, 1965).

Положение митоза в клеточном цикле фиксировано, и его продолжительность невелика. Зависимость между митотическим индексом (МИ) и Т выражается следующей формулой:

о/М

МИ=1п-^-

(Smith, Dendy, 1962). 9*

Поскольку клетки в фазе G1 обладают одинарным набором ДНК, а клетки в фазе G2 — двойным набором ДНК, то в культуре экспоненциально растущих клеток среднее содержание ДНК на клетку будет в 1,3 раза выше, чем в клетках, находящихся в фазе G1.

10.6. Пролиферативный пул

В большинстве клеточных популяций не все клетки размножаются, какая-то часть клеток не пролиферирует. Эти клетки можно рассматривать как клетки, находящиеся в фазе GO или в состоянии А. Величина фракции растущих клеток, или про-лиферативного пула, описывается выражением

N_c _ Число пролиферирующих клеток

N Общее число клеток

Время, потребное для удвоения общего числа клеток в такой культуре, не равно времени клеточного цикла или времени генерации. В связи с этим представляется важным, чтобы при исследовании клеточного цикла проводилось различие между Тъ и Г и величина пролиферативного пула поддерживалась как можно более высокой.

Низкий пролиферативный пул — явление обычное in vivo (даже у некоторых опухолей пролиферативный пул может быть ниже 0,1), но и in vitro в первичных культурах клеток или в культурах, растущих в субоптимальных условиях, зачастую де* лятся не все клетки. Снижение пролиферативного пула может происходить вследствие 1) необратимой дифференцировки, 2) вступления клеток в фазу GO или в состояние А, 3) гибели клеток.

Рис. 10.6. Равновесное распределение клеток по клеточному циклу. При равновесии число клеток, возникающих благодаря клеточному делению, оказывается в точности равным числу клеток, теряющихся в результате гибели или миграции, так что общее число клеток в той или иной фазе цикла оказывается пропорциональным продолжительности этой фазы.

В стационарном состоянии, когда увеличение числа клеток в результате деления уравновешивается потерей части клеток из популяции, распределение клеток по фазам оказывается прямоугольным (рис. 10.6) и относительное количество клеток в той или иной фазе становится прямо пропорциональным относительной продолжительности этой фазы, т. е.

Митотический индекс (МИ) = ДО/Т,

Более подробную информацию о кинетике клеточного цикла можно найти в соответствующих монографиях (Cleaver, 1967; Aherne et al., 1977).

10.7. Анализ клеточного цикла

10.7.1. Метод импульсного включения тритированного тимидина (Howard, Pelc, 1953)

Этот метод наиболее прост, и приведенное ниже описание предназначено для клеток, растущих в маленьких чашках или на покровных стеклах. Метод может быть модифицирован для применения в суспензионных культурах.

— Установить серию покровных стекол в многолуночные пластинки (разд. 2.2). На один опыт требуется не менее 48 стекол, т. е. 2 многолуночных пластинки. В каждую лунку высеять ЫО⁴—2»10⁴ клеток в 0,5 мл среды. Клетки инкубировать в течение ночи для достижения фазы экспоненциального роста. Предпочтительно использовать среду с буфером Hepes, поскольку периодический отбор стекол с клетками затрудняет поддержание рН с помощью бикарбонатного буфера. Важно также не допускать падения температуры при отборе стекол с клетками, в связи с чем эту операцию лучше проводить в термостатированной комнате (при 37 °С).

— Инкубировать каждую культуру с ³Н-тимидином в течение 30 мин (5 мкКи/мл; 2 Ки/ммоль). Для этого в каждую лунку, содержащую 0,5 мл среды, добавить 10 мкл раствора, содержащего 2,5 мкКи ³Н-тимидина в концентрации 1,25- Ю^-4 М.

— Удалить среду, содержащую ³Н-тимидин, используя для этой цели пастеровскую, пипетку, соединенную через ловушку с вакуумным насосом. Быстро добавить в лунки прогретую среду с немеченым тимидином (2-10~⁶М).

— Фиксировать покровные стекла через равные интервалы времени (20—30 мин), последовательно ополаскивая стекла в ФСБ (дважды), в 5%-ной холодной ТХУ (4 раза) и абсолютном этаноле (дважды). Приклеить покровные стекла к предметному, используя DePeX (Pearse, 1953) и подготовить препараты для радиоавтографии (см. разд. 12.4).

Рис. 10.7. Фракция меченых митотических клеток. Сплошной линией обозначена теоретическая кривая изменения фракции митотических клеток после влечения их в течение 100 мин тритированным тимидином. Пунктирной линией обозначены результаты, полученные с мышиными L-клетками. Заштрихованными участками показана продолжительность инкубации клеток с тритированным тимидином. [Перепечатано с любезного разрешения автора (Cleaver, 1967).]

DePeX производится фирмой G. Т. Gurr Ltd. (приложение 3).

— На радиоавтографах подсчитать относительное количество меченых митотических клеток. Теоретически первые меченые митотические клетки должны появляться после промежутка времени, равного продолжительности фазы G2 (/G2), и количество меченых митотических клеток должно увеличиваться до 100% в течение tM. (рис. 10.7). В течение tS относительное содержание меченых митозов должно снижаться, и. новое появление меченых митозов должно иметь место после интервала времени, равного сумме tQl и tG2.

На практике из-за различий между клетками и из-за трудностей, связанных с кратковременной (импульсной) меткой, границы между этими событиями оказываются размытыми. При использовании 50%-ных значений для обозначения границ переходов можно получить разумные приближения к истинным значениям продолжительностей различных фаз клеточного цикла.

10.7.2. Метод непрерывного мечения

— Высеять и инкубировать клетки с ³Н-тимидином, как указано выше, с той лишь разницей, что концентрация тимидина должна быть равной 2,5 мкКи/мл (0,06 Ки/ммоль).

— Не удалять среду с тритированным тимидином и в ходе инкубации через определенные интервалы отбирать клетки.

— Подготовить препараты для радиоавтографического анализа и подсчитать относительное количество меченых митозов, относительное количество меченых клеток и среднее число зерен серебра над клетками (рис. 10.8).

Относительное количество меченых клеток достигает 1,0 только после того, как все клетки, не находящиеся первоначально в фазе S, пройдут весь цикл и достигнут фазы S, т. е. после времени Т—tS, которое в дан-

Рис. 10.8. Метод непрерывного мечения. Культуры эпителиальных клеток кожи человека непрерывно инкубировали с тритированным тимидином (2,5 мкКи/мл; 0,06 Ки/моль) в течение 25 ч и в течение „-„ __„„_вл /_„/ _1ЛСч „_л этого времени отбирали клетки для под-ном случае (рис. 10.8) со- _{счета у}£_{азаиных} параметров. ГПерепеча-

ставляет 16,3 ч и состоит из тано с любезного разрешения автора /Gl+to2 + /M. Величина (Cleaver, 1967).]

tG2, как и в предыдущем

случае, представляет собой время, необходимое для появления первого меченого митоза. Величина tGl может быть рассчитана по величине митотического индекса (относительного количества митотических клеток):

МИ.

(Smith, Dendy, 1962).

Число зерен серебра над клеткой достигает постоянного уровня, когда клетки проходят всю фазу S в присутствии ³Н-тимидина. Однако при делении таких клеток метка распределяется между дочерними клетками, и число зерен серебра над клеткой падает. Это вносит ошибку в определяемое значение tS. Ошибки вносятся также из-за того, что в моменты внесения тритированного тимидина или сбора клеток часть клеток находится в фазе S. Таким образом, этот метод дает завышенную оценку значения /S.

10.7.3. Функции накопления

Некоторую информацию можно получить, изучая накопление митотических клеток при добавлении агентов, блокирующих митоз. Культуры устанавливались, как указывалось выше, и в нулевой момент времени в культуры добавляли колцемид (0,25 мкг/мл).

На рис. 10.9 показано, что после короткого лаг-периода зависимость функции накопления [\g(l+Nm)_t где Nm представ-

Рис. 10.9. Накопление митотических клеток. Показана зависимость функции накопления митотических клеток lg (\+Nm) от времени для клеток китайского хомячка (7=12,4 ч) и клеток HeLa (7=20,1 ч), к которым в нулевое время добавляли колцемид. [Перепечатано с любезного разрешения автора (Puck,

1964) и издателей.]

ляет собой относительное количество митотических клеток] от времени становится линейной. Пользуясь этим графиком, можно вычислить время генерации (Г), либо используя уравнение

l_g (1 +Nm) =0,30ttM+*/7\

где /М — продолжительность митоза, a t — время после добав^: ления колцемида, либо определяя время, в течение которого функция накопления достигнет значения 0,3. Характер экспериментальных кривых часто не соответствует, этому теоретическому представлению. Это обусловлено тем, что 1) время генерации варьирует от клетки к клетке, 2) жизнеспособными могут оказаться не все 100% клеток, 3) часть клеток может избежать действия колцемида и вступить в фазу G1 и 4) колцемид может оказать действие на другие фазы клеточного цикла и тем самым изменить время генерации. Лаг-период в скорости накопления митотических клеток, наблюдаемый сразу после добавления колцемида, объясняется тем, что часть клеток при добавлении препарата уже находится в митозе; эти клетки не блокируются, а заканчивают митоз и входят в фазу

Рис. 10.10. Накопление меченых митотических клеток. Эксперимент с клетками HeLa S3, аналогичный отображенному на рис. 10.9, но в данном случае в нулевой момент времени вместе с колцемидом был добавлен ⁸Н-тимидин. После начального лаг-периода кривая накопления всех митотических клеток проходит параллельно кривой накопления меченых митотических клеток и расстояние между ними соответствует продолжительности фазы G2 [Перепечатано с любезного разрешения авторов (Puck, Steffen, 1963) и издателей.]

G1. Тэйлор (Taylor, 1965) показал, что такая ситуация имеет место при использовании родственного алкалоида, колхицина, в концентрации между 50 и 200 нМ, но при концентрациях выше 200 нМ все клетки блокируются в митозе.

Если одновременно с колцемидом в культуры добавлять три-тированный тимидин, то можно построить три кривые накопления: а) общего накопления меченых клеток, б) общего накопления митозов и в) накопления меченых митозов. На основании этих трех кривых можно вычислить продолжительность фаз S и G2, а следовательно, и фазы G1.

Как показано на рисунке 10.10, расстояние между кривыми дает точное значение продолжительности фазы G2. Если популяция клеток находилась на стадии экспоненциального роста и тритированный тимидин не оказывал повреждающего действия на клетки, то кривые на рис. 10.10 должны быть параллельны. Значение времени генерации может быть получено из угла наклона этих кривых, который равен 0,3/Г.

Используя полученное значение продолжительности фазы G2, можно построить график (рис. 10.11) зависимости

lg(l + ^N^ ) от времени, где N(L)—доля меченых клеток, а

£=ехр (1п2—?-) (Puck, Steffen, 1963; Puck et al., 1964). Эта

функция достигает плато, когда все клетки из фазы G1 переходят в фазу S или (при промежуточных концентрациях колцемида) все клетки из фаз М и G1 переходят в фазу S. Поскольку продолжительность фазы G1 в клеточной популяции значительно варьирует, то переход кривой в плато оказывается сглаженным. Поэтому следует проводить прямую линию через точки, полученные в течение первых 6 ч (или около этого) эксперимента. Далее следует найти точку пересечения этой прямой с линией, проведенной параллельно оси абсцисс на уровне, соот-

Рис. 10.11. Накопление меченых клеток. Экспериментальные точки на этом графике могут быть получены из эксперимента, приведенного на рис. 10.10. По оси ординат отложена функция накопления lgfl-HV (!)/£], где N(L)—общее число меченых клеток, a k=2^tG2. [Перепечатано с любезного разрешения авторов (Puck, Steffen, 1963) и издателей.]

ветствующем значению функции через 24 ч после начала эксперимента. Пересечение экспериментальной прямой с осью ординат (0,3/S/r) может быть использовано для вычисления продолжительности фазы S.

Хотя в основе этого метода лежат более сложные математические вычисления, чем в случаях ранее рассмотренных методов [более подробно об этом см. в монографии Клевера (Cleaver, 1967)], при его применении требуется меньше экспериментальных точек, получаемых в течение более короткого промежутка времени.

10.7.4. Графический анализ

Наиболее простой метод анализа клеточного цикла предложил Окада (Okada, 1967). Этот метод помимо оценки продолжительности фаз клеточного цикла позволяет получить дополнительную информацию о количественном распределении клеток по фазам цикла.

Для применения этого метода требуется следующая информация о клетках экспоненциально растущей культуры.

A. Время генерации, которое либо может быть определено как время удвоения клеток, либо вычислено по функции накопления (разд. 10.7.3).

Б. Митотический индекс (разд. 10.5).

B. Относительное количество клеток в фазе S, вычисленное при импульсном мечении клеток ³Н-тимидином (разд.

10.7.1).

Г. Продолжительность фазы G2, установленная либо путем

Рис. 10.12. Графический анализ клеточного цикла. Культуры клеток комара Aedes albopticus в чашках Петри диаметром 5 см регулярно анализировали для установления продолжительности времени удвоения (принимаемого за время генерации). После установления экспоненциального роста культуры к клеткам добавляли ⁸Н-тимидин и колцемид и клетки продолжали инкубировать для определения процента меченых клеток, митотического индекса и tG2. Способ построения графика указан в тексте (см. разд. 10.7,4).

оценки промежутка времени между добавлением ³Н-тими-дина и появлением меченых митотических клеток, либо по расстоянию между кривыми на рис. 10.10. Эксперименты для получения всей этой информации занимают 3—4 ч с использованием и без использования колцемида. Затем на полулогарифмической миллиметровой бумаге строят следующую диаграмму (рис. 10.12).

— Отложить время генерации на линейной оси, а на логарифмической оси разделить участок между 1 и 2 на 100 делений (100%) так, чтобы точка 1 совпала с 0%, а точка 2 — с 100%. Соединить прямой линией точки Т и 100%.

— Из точки Т (соответствующей 11 ч) провести вертикальную линию, длина которой соответствовала бы относительному количеству клеток в митозе, и через конец этого отрезка провести прямую, параллельную оси абсцисс. Длина этой прямой до пересечения с диагональной линией дает продолжительность фазы М.

— Продолжить горизонтальную линию на расстояние, равное продолжительности фазы G2, и конец отрезка соединить вертикальной линией с диагональной прямой. Это расстояние соответствует относительному количеству клеток в фазе G2.

— Продолжить вертикальную линию на расстояние, равное относительному количеству клеток в фазе S, и конец отрезка

соединить горизонтальной линией с диагональной прямой. Это расстояние соответствует продолжительности фазы S. — Два последних отрезка (горизонтальный и вертикальный) соответствуют продолжительности фазы G1 и относительному количеству клеток в фазе G1.

10.7.5. Проточная микрофлуориметрия

Установка, разработанная в Лос-Аламосской научной лаборатории, позволяет проводить анализ большого количества одиночных клеток относительно содержания в них ДНК и белка, клеточного объема и т. д. (Fulwyler, 1965; Kraemer et al., 1973; Klevecz et al., 1975; Herzenberg et al., 1976). На выходе прибора могут быть получены такие параметры большой популяции клеток, как распределение клеток по содержанию ДНК, по размеру клеток и т. п. Помимо возможности такого комплексного анализа установка обеспечивает физическое разделение клеток на субпопуляции по тому или иному интересующему исследователя параметру.

Клетки окрашиваются флуоресцирующим красителем, специфическим для отдельных клеточных компонентов (может быть использован бромид этидия в концентрации 0,1 мг/мл для окраски ДНК или флуоресцирующие антитела). Анализ окрашенных клеток производится по мере их прохождения одна за другой через сенсорное устройство. Так, при прохождении клетками расположенного перпендикулярно луча аргонового лазера (время прохождения 2—3 мкс) каждая клетка дает вспышку флуоресценции, которая может быть проанализирована как по интенсивности, так и по цвету. Кроме того, сигнал, соответствующий клеточному объему, может генерироваться путем установки диафрагмы счетчика Коултера на пути прохождения клеток либо, что проще, путем измерения рассеянного света вторым фотоумножителем, установленным под прямым углом к лазерному лучу. Информация, полученная в результате измерения флуоресценции клеток и светорассеяния, позволяет воссоздать трехмерную картину числа клеток, их объема и содержания в них ДНК.

Сортировка клеток осуществляется путем преобразования непрерывного тока жидкости с клетками в капли, причем 1% капель содержит по одной клетке. Капли формируются и проходят между заряженными пластинами через определенное время после анализа клеток. Клетки, представляющие интерес для исследователя (например, содержащие ДНК в количестве, характерном для фазы G2), могут быть отобраны путем внесения в поток клеток заряда на короткое время, достаточное

для того, чтобы три капли (средняя из которых содержит интересующую исследователя клетку) при прохождении между электродами отклонились в отдельную собирающую пробирку.

В качестве примера рассмотрим результаты эксперимента, в котором клетки СНО, импульсно меченные ³Н-тимидином, были окрашены бромидом этидия или с помощью флуоресцентной (с ак-рифлавином) модификации метода Фёльгена (метод специфической окраски ДНК) и использованы для микрофлуориметриче-ского анализа в протоке и сортирования клеток. На рис. 10.13 приведены результаты определения распределения клеток по содержанию ДНК. Около 61% клеток содержат ДНК в количестве, характерном для клеток в фазе G1, и около 16,3% клеток содержат диплоидное количество ДНК, характерное для клеток в фазах G2 и М. Остальные 23% клеток содержат промежуточное количество ДНК. Было использовано уравнение, предложенное Лен-нартцем и Маурером (Lennartz, Maurer, 1964):

Рис. 10.13. Распределение клеток, разделяемых методом микрофлуо-риметрии в потоке. Клетки СНО импульсно метили *Н-тимидином в течение 15 мин (1 мкКи/мл) и затем окрашивали бромидом этидия. Клетки переносили затем в проточный микрофлуориметр и сорти-

?овали на основе содержания в них [НК-Клетки из указанных фракций (1, 2 и 3) анализировали затем с помощью радиоавтографии и показали, что содержание меченых клеток в этих фракциях составляет соответственно 4, 93, и 19%. [Перепечатано с любезного разрешения авторов (Kraemer et al., 1973) и издателей.]

ехр

1-е

ln2Jd01n-|-,

где dN/Nt представляет собой фракцию клеточной популяции, занимающую интервал d8 клеточного цикла в момент времени t.

Пользуясь этим уравнением, графически представленным на рис. 10.5, можно вычислить продолжительность фаз G1 (8,4 ч), G2+M (3,5 ч) и S (4,1 ч). Как показывает радиоавтографический анализ, во фронтальной части пика клеток в фазе G1 (рис. 10.13) лишь 4% клеток оказываются мечеными. В нисходящей части пика клеток в фазах G2+M мечеными оказываются 19% клеток, а в промежутке между этими пиками мечеными оказываются 93% клеток.

О высокой чувствительности метода свидетельствует тот факт, что с его помощью выявляется минорная фракция кле-

ток, представляющая менее 1% клеток популяции, содержание ДНК в которых вдвое превышает таковое в клетках в фазах G2+M.

Разработана программа для ЭВМ, позволяющая с высокой точностью оценить субпопуляции клеток в фазах Gl, S и G2+M по результатам проточной микрофлуориметрии (Dean, Jeff, 1974). Сортирование клеток производится со скоростью 50 000 клеток в 1 мин, так что для разделения 10⁶ клеток требуется 20 мин. Следовательно, эта очень дорогая установка может быть использована только для последующего биохимического анализа, использующего высокочувствительные методы.

10.8. Яды, облучение и клеточный цикл

10.8.1. Фаза S

Синтез РНК необходим для вступления клеток в фазу S, но не для самого синтеза ДНК, хотя фаза S не завершается в присутствии актиномицина (специфического ингибитора синтеза РНК). Добавление актиномицина D через 2 ч после начала фазы S не препятствует ее завершению, но при этом клетки далее не проходят через фазу G2 и не делятся (Mueller, Kajiwara, 1966). Авторы предполагают, что синтез РНК в конце фазы S необходим для репликации последних 3% ДНК.

Подавление синтеза белка оказывает немедленное действие на синтез ДНК (Stimac et al., 1977). Скорость движения реп-ликационной вилки снижается в течение 15 мин после подавления синтеза белка, причем степень подавления синтеза белка коррелирует со степенью подавления включения ³Н-тимидина в ДНК в течение 60 мин. В дальнейшем угнетение синтеза ДНК усиливается вследствие снижения частоты инициации новых репликонов. Синтез ДНК не столь чувствителен к ингибиторам белкового синтеза, как сам синтез белка, вследствие чего хроматин, образованный в присутствии ингибиторов белкового синтеза, оказывается обедненным белками (White, Eason, 1973) и более чувствительным, к действию нуклеаз (Weintraub, 1976).

Ингибиторы синтеза ДНК несомненно блокируют прохождение клетками фазы S. К числу таких ингибиторов относятся аналоги фолиевой кислоты (аминоптерин и аметоптерин; разд. 11.8.1 и 13.2.1), фтордезоксиуридин (разд. 11.8.2) и ингибиторы рибонуклеотидредуктазы (гидроксимочевина и высокие концентрации тимидина; см. разд. 11.8.3 и 11.8.4).

10.8.2. Фаза G2

Логарифм общего числа клеток является линейной функцией времени для культур в экспоненциальной фазе роста. Следовательно, если в нулевое время в культуру добавить ингибитор,

останавливающий продвижение клеток по циклу во время t перед клеточными делениями, то делиться будут только те клетки, которые от клеточного деления отделяет время, меньшее чем /. Логарифм числа клеток будет линейно расти в течение времени г, после чего кривая сделает изгиб, обозначая тем самым точку действия ингибитора в клеточном цикле (Tobey et al., 1971).

Эксперименты с использованием актиномицина D выявили необходимость в синтезе РНК за 30 мин до митоза (Kishimoto, Lieberman, 1964; Arrighi, Hsu, 1965). Использование пуромици-на показало необходимость синтеза белка в течение фазы G2 для последующего деления клеток (Kishimoto, Lieberman, 1964). Более точные эксперименты, проведенные на клетках СНО, выявили потребность в синтезе РНК для митоза за 1,8 ч до деления и прекращение зависимости митоза от синтеза белка за 0,6 ч до митоза (Tobey et al., 1966).

Аналогичным образом была выявлена точка в клеточном цикле, когда клетки оказываются чувствительными к низким дозам рентгеновского облучения. Доза облучения в 9 рад не оказывает токсического действия, но временно снижает скорость

Рис. 10.14. Влияние низких доз рентгеновского облучения на накопление митотических клеток. Эксперимент проводился так же, как описано для клеток HeLa на рис. 10.9, но через 3 ч после добавления колцемида половину культур облучали рентгеном (9 рад) (нулевое время на графике). Через 0,6 ч перед профазой (А) продвижение клеток к митозу полностью подавляется, но спустя еще 0,7 ч (Б) митотические клетки начинают накапливаться с нормальной скоростью. Следовательно, облучение влияет только на небольшую часть клеток, находящихся в положении 0,6—1,3 ч перед профазой. Через 1,95 ч в этих клетках восстанавливается способность к митозу, О контрольные необ-лученные клетки; ? облученные клетки. (Puck, Steffen, 1963.)

прохождения клетками фазы G2 (рис. 10.14). Чувствительный к облучению этап расположен за 0,7—1,4 ч до митоза. Рентгеновское облучение клеток в этот интервал времени полностью блокирует клеточное деление. Однако через 1,35 ч клетки «излечиваются» и, подобно необлученным клеткам, проходят клеточный цикл, так что между 2,05 и 3 ч после облучения накопление митозов в облученной культуре происходит с большей скоростью, чем в контрольной необлученной культуре.

10.S.3. Фаза G1

Для прохождения, клетками фазы G1 необходим синтез РНК и белка. Кроме того, как указывалось выше (разд. 10.6; см. также разд. 2.3 и гл. 15), различные ситуации, включая субоптимальные условия роста и стимуляцию дифференцировки (например, добавление диметилсульфоксида к клеткам эритролей-коза Фрейд), могут приводить к остановке клеток в фазе G1.

Используя мутантные линии клеток, удалось показать необходимость активности РНК-полимеразы II в середине фазы G1 для последующего вхождения клеток в фазу S (Rossini, Baser-ga, 1978).

10.9. Тимидинкиназа и моделирование клеточного цикла на ЭВМ

Изучение клеточного цикла затрудняется тем, что слишком много переменных могут оказать влияние на предсказание судьбы клетки. Многочисленные данные свидетельствуют об изменении активности ряда ферментов в течение клеточного цикла. Нетрудно представить, что эти изменения имеют существенное значение для контроля клеточного цикла на самых различных уровнях. Наиболее изученным из ферментов этого класса является тимидинкиназа (Adams, 1969а; Stubblefield, Mueller, 1965; Littlefield, 1966а, b; Bello, 1974), но периодические изменения отмечены также для дезоксицитидинкиназы (Brent, 1971), тими-дилаткиназы (Brent et al., 1965), дезоксицитидилатдезаминазы (Gelbard et al., 1969), рибонуклеотидредуктазы (Turner et al., 1968; Murphree et al., 1969) и ДНК-полимеразы a (Lindsay et al., 1970; Furlong et al., 1973).

В каждом случае активность фермента увеличивается в течение фазы S и снижается в конце фазы G2 или самом начале фазы G1. Было показано (Bello, 1974), что стабильность тими-динкиназы слабо изменяется в течение клеточного цикла и инициация синтеза фермента происходит одновременно, но независимо от инициации синтеза ДНК. Окончание синтеза фермента требует завершения фазы S и оказывается зависимым от синтеза РНК в течение фазы G2.

В Хьюстонском университете Донаги (Donaghey) разработал для ЭВМ «Cell Sim» программу, с помощью которой было проверено предположение о том, что мРНК для тимидинкиназы синтезируется с постоянной скоростью только в течение фаз S и G2 и немедленно транслируется в активный фермент (Stub-blefield, Dennis, 1976). Эта модель нашла количественное подтверждение в культуре фибробластов китайского хомячка с известными параметрами клеточного цикла при условии, что каждая клетка синтезирует в минуту одну молекулу мРНК в течение фаз S и G2 и каждая мРНК в течение трех минут транслируется в молекулу фермента. Время полужизни мРНК и фермента в этой системе составляет соответственно 9 и 150 мин. Предложенная модель не в состоянии объяснить быстрое падение активности тимидинкиназы в начале фазы G1, в связи с чем дополнительно постулируется снижение стабильности фермента в этот период клеточного цикла. Этот постулат, соответствующий данным о снижении времени полужизни тимидинкиназы с 6,2 до 4,4 ч между ранней фазой S и ранней фазой G1 в клетках KB (Bello, 1974), не учитывается в исходной компьютерной программе, но заложен в программу «Cell Sim II».