Дифференцировка в культурах клеток

Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

Изучение процессов дифференцировки у многоклеточных организмов связано со множеством проблем, возникающих из-за сложного и мало понятного взаимодействия различных тканей. Эти взаимодействия могут быть ограничены или устранены при работе с культурами клеток. Ниже приведено описание нескольких систем, изучение которых может пролить свет на механизм дифференцировки клеток и тканей.

15.1. Эритроидная дифференцировка клеток Френд

Процессы эритропоэза рассмотрены в работах Гаррисона (Harrison, 1976, 1977) и Оркина (Orkin, 1978). Эритроидные клетки, так же как и другие клетки крови, образуются из общих гема-топоэтических стволовых клеток. После установления компетентности к эритроидной дифференцировке стволовые клетки пролиферируют в течение нескольких генераций, становясь чувствительными к гормону эритропоэтину, который стимулирует пролиферацию компетентных эритроидных стволовых клеток и проэритробластов, дифференцирующихся затем в зрелые эритроидные клетки, содержащие гемоглобин.

Изучение процесса дифференцировки в нормальных эритроидных системах тормозится трудностями, связанными с получением достаточного количества эритроидных клеток на определенной стадии развития.

Клетки Френд представляют собой клетки мышиного, индуцированного вирусом эритролейкоза, которые растут в суспензионной культуре и характеризуются ограниченной степенью дифференцировки в ряду эритроидных клеток (Friend et al., 1966; Patuleia, Friend, 1967). Клетками-мишенями для вируса Френд являются, по-видимому, поздние компетентные стволовые клетки. При нормальных условиях роста только 1—2% клеток окрашиваются бензидином (гемоглобин-положительные). Эти клетки, очевидно, задерживаются на стадии проэритробластов и не чувствительны к эритропоэтину. Однако в ответ на обработку диметилсульфоксидом (2%) содержание бензидин-положительных клеток увеличивается после 3-дневного лаг-периода и к 5-му дню достигает 96% (Friend et al., 1971), т. е.> клетки претерпевают серию изменений, характерных для дифференцировки нормальных эритроидных клеток.

В опубликованном несколько лет назад обзоре (Marks, Rif-kind, 1978) рассматриваются особенности индуцированной дифференцировки и перечислено большое количество индукторов (масляная кислота, гемин, уабаин), которые могут быть использованы вместо диметилсульфоксида. Однако не все эти индукторы вызывают те же самые эффекты во всех клонах, и некоторые резистентные к диметилсульфоксиду варианты обладают различными фенотипами (Harrison et al., 1978).

Клетки Френд, следовательно, могут использоваться в качестве идеальной системы in vitro для изучения дифференцировки, и было показано, что обработка диметилсульфоксидом приводит к прекращению клеточных делений и образованию гло-биновых мРНК (Harrison, 1976; Minty et al., 1978). Индукция глобинОвых мРНК специфически блокируется гидрокортизоном (Scher et al., 1978) и зависит от некоторых событий, происходя-* щих в фазе G1 синхронизированных клеток (Gampari et аЦ 1978). Однако вопрос о том, имеет ли существенное значение для дифференцировки синтез ДНК, остается открытым (Harrison, 1976).

В отсутствие индуктора клетки Френд продолжают нормально делиться, но в присутствии диметилсульфоксида жизнеспособность клеток значительно снижается, хотя количество клеток может увеличиваться в 10 раз.

15.1.1. Индукция синтеза глобина в клетках Френд

В чашки Петри диаметром 6 см посеять по 10⁶ клеток в 10 мл БСИ, содержащей 15% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, и добавить химически чистый диметилсульфоксид (нестерилизованный или стерилизованный автоклавированием в небольшом объеме) до концентрации 2%. Через 5—6 дней инкубации клетки промыть ФСБ и лизировать в дистиллированной воде. Содержание гемоглобина можно оценить, измеряя оптическую плотность просветленной надосадочной фракции при 415 нм. Можно также инкубировать клетки с ⁵⁹Fe и оценивать синтез гемоглобина по радиоактивности гема, экстрагированного из лизата клеток.

15.2. Кожа и кератиноциты

Дифференцировка эпидермальных клеток в базальный слой делящихся клеток и верхний слой или слои клеток, которые кератинизируются и впоследствии слущиваются, представляет

^--

относительно простую систему и может быть еще более упрощена благодаря способности кератиноцитов к росту в культуре.

Такая система in vitro может быть использована для изучения не только дифференцировки кожи и различных ее патологических изменений, но также и для тестирования лекарственных препаратов, влияющих на эпидермис человека, а возможно, и для получения большого количества эпидермальных клеток, которые можно было бы использовать при трансплантации кожи.

Поддержание, и рост эпидермальных клеток зависят от присутствия фибробластов или продуктов их жизнедеятельности, и при оптимальном соотношении этих двух типов клеток в культуре наблюдается хороший рост и дифференцировка клеток. Однако продолжительность жизни., таких клеток ограничена 20—50 генерациями (Hayflick, Moorhead, 1961), что значительно ниже продолжительности жизни клеток в базальном слое эпидермиса человека, которые претерпевают 30 делений в год. Продолжительность жизни клеток в культуре может быть увеличена до 150 генераций добавлением эпидермального ростового фактора (Rheinwald, Green, 1977; см. разд. 7.7.2). Содержание сАМР также может играть существенную роль в регуляции роста (Green, 1978).

Ниже описан метод выращивания кератиноцитов из полученных биопсией кусочков кожи с использованием фидерного слоя (Rheinwald, Green, 1975). В качестве фидерных клеток можно использовать клетки ЗТЗ или ВНК21, обработанные гамма-лучами или митомицином С, как описано в разд. 8.1.5.

— Разрезать кусочки кожи (разд. 6.3) в МСИ в модификации Дюльбекко с 10% сыворотки (приложение 1J и тонко измельчить.

— Перемешивать в 10 мл 0,25%-ного трипсина в ФСБ-А при 37 °С.

— Каждые 30 мин давать оседать комкам ткани в течение 1 мин и удалять надосадочную жидкость, заменяя ее свежим трипсином.

— Осадить клетки из надосадочной жидкости и ресуспендиро-вать их в ростовой среде, содержащей 20% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и гидрокортизон (0,4 мкг/мл). Это ускоряет рост и делает морфологию колонии более упорядоченной.

— Смешать с суспензией фидерных клеток и распределить клетки по чашкам. Соотношение двух типов клеток влияет на характер последующего роста.

— Чашки с культурами не следует трогать, поскольку эпидер-мальным клеткам требуется для прочного прикрепления 2—3 суток. После этого времени среду нужно менять дваж-

t

ды в неделю. Рост фибробластов в этих условиях бывает в основном подавлен, а эпидермальные клетки образуют колонии кератиноцитов, вытесняющие фидерный слой к периферии.

— Для пересева кератиноцитов следует вначале обработать культуру 0,02% ЭДТА в течение 15 с и интенсивно пипети-ровать для избирательного удаления фибробластов.

— После этого дезагрегировать колонии кератиноцитов с помощью 0,02% ЭДТА и 0,05% трипсина (1 : 1). При пересеве кератиноцитов в случае необходимости добавлять новый фидерный слой.

Если культуры не пересевать, то клетки полностью заполняют монослой и начинают слущиваться с верхнего слоя, тогда " как клетки базального слоя продолжают делиться (Green, 1977). Таким образом, эта система близко напоминает многослойный эпителий in vivo, где базальные клетки размножаются, а не базальные клетки дифференцируются.

15.3. Клетки тератокарциномы

Тератомам и тератокарциномам посвящены два опубликованных в последние годы обзора (Hogan, 1977; Illmensee, Stevens, 1979). Тератомы представляют собой опухоли, возникающие в яичниках или семенниках или у. зародышей, на ранних стадиях развития трансплантированных во внематочные участки. Тератомы состоят из многих тканей, среди которых можно различить кожу, нервы, мышцы, хрящи и т. д. Если среди идентифицируемых тканей обнаруживаются недифференцированные эмбриональные клетки, то такие опухоли называются тератокар-циномами и характеризуются более высокой скоростью роста и способностью к трансплантации сингенным животным (т. е. животным с тем же самым генотипом). Включение клеток мышиной тератокарциномы в клеточную массу ранних мышиных эмбрионов приводит к получению совершенно нормальных химерных взрослых особей, у которых клетки тератокарциномы оказываются включенными во многие различные ткани (Mintz, Illmensee, 1975; Papioannou et al., 1975). Таким образом, эти клетки способны к участию в нормальном морфогенезе и дифференцировке in vivo, и в настоящее время в работе многих исследователей делаются попытки воспроизвести эти события in vitro. Было получено несколько клеточных линий, которые в ответ на стимуляцию дифференцируются быстро и в предсказанном направлении.

Разработано два метода получения культивируемых клеток мышиной тератокарциномы.

1. Опухолевым клеткам дают прикрепиться к покрытому желатином дну культурального сосуда (разд. 2.3.2), что со-

провождается образованием колоний различных типов клеток, включая эмбриональные. Последние могут вытеснять дифференцированные клетки и могут быть проклонированы (гл. 8) (Rosenthal et al., 1970; Bernstine et al., 1973). Выделенные этим способом линии клеток имеют тенденцию к потере способности дифференцироваться в ходе культивирования.

2. Опухолевые клетки (асцитные или диссоциированные из солидных опухолей) высевают на монослой фидерных фибро-бластов (разд. 8.1.5). Через несколько дней в культуре можно видеть много различных видов дифференцированных клеток, и в том числе колонии эмбриональных клеток. При повторном пересеве эти клетки доминируют, но возможно, что проще отобрать их вручную и пересеять на фидерный слой (Martin, Evans, 1975а).

Будучи выделенными, недифференцированные клетки остаются гомогенными до тех пор, пока они субкультивируются в модифицированной Дюльбекко среде Игла с 5—20% сыворотки крупного рогатого скота, и снимаются с субстрата 0,25%-ным трипсином и 0,05 мМ ЭДТА в ФСБ (гл. 5) до достижения клетками полного монослоя.

Если клетки тератокарциномы достигают полного монослоя, то они могут начать дифференцироваться во многие различные типы клеток, но этот процесс не так выражен, как дифферен-дировка у клеток, полученных по методу 2 и перенесенных в сосуд без фидерного слоя. В этих условиях клетки плохо прикрепляются и образуют комки в суспензии. Эти комки сохраняют жизнеспособность и быстро дифференцируются (Evans, 1972), образуя внешний слой эндодермальных клеток. Присутствие эндодермы легко обнаружить по активности типичного маркера эндодермальных клеток, сериновой протеазы, активатора плазминогена (Strickland et al., 1976).

Эти агрегаты известны под названием эмбриоидные тельца. После 2—3 дней культивирования они развиваются в наполненные жидкостью цисты, в которых видны признаки дифференцировки. Если дать этим агрегатам прикрепиться к поверхности культурального сосуда, то из них вырастает несколько типов дифференцированных тканей, включая .сокращающиеся мышцы, нервы и железистые ткани (Martin, Evans, 1975b).

Некоторые линии клеток тератомы, полученные методом 1 (например, линия клеток F9), почти полностью потеряли способность к дифференцировке. Однако недавно было показано, что дифференцировка может быть индуцирована и в этих клетках, если инкубировать их с 10~⁹М ретиноевой кислотой (Strickland, Mahdavi, 1978). Образование эндодермы в этих дифференцирующихся клетках также выявляется по образованию активатора плазминогена.

15.4. Культуры миеломных клеток 'и образование антител

Зрелые дифференцированные лимфоциты в норме синтезируют и секретируют in vivo молекулы иммуноглобулинов (Ig). Миеломы (опухоли) плазматических клеток (плазмацитомы) обычно синтезируют и могут секретировать один вид иммуноглобулина (миеломный белок), хотя миеломы, полученные на ранней стадии дифференцировки лимфоцитов, могут синтезировать более одного вида Ig, например линия SAMM 368. Поскольку миеломы образуются из предварительно стимулированных лимфоцитов, то специфичность продуцируемых ими антител (Ig) неизвестна. Было показано, что часто используемая линия "миеломы МОРС 315 продуцирует иммуноглобулины, обладающие сродством к нескольким из большого числа испытанных антигенов. Природа и возможности использования миелом рассматриваются в специальных обзорах (Potter, 1972, 1975, 1976; Rabbitts, Milstein, 1977).

Плазмацитомы могут возникать спонтанно или могут быть индуцированы (обычно в инбредных линиях мышей BALB/c или NZB) введением минерального масла или пластиковых пластинок. Опухоли обычно пассируются на мышах в солидной или асцитной форме, но могут быть также адаптированы к росту in vitro, где они, как правило, растут в суспензии; в этих условиях, однако, они имеют тенденцию к потере Ig-синтети-ческой активности.

Клетки плазмацитом гипердиплоидны и характеризуются высокой скоростью роста. Они растут в среде RPMI 1640 (гл. 7 и приложение 1) с 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и 1% глутамина. Они слабо прикрепляются к поверхности, но могут расти в стационарной культуре или во вращающихся бутылях при плотности 2-Ю⁵—8-10⁵ клеток в 1 мл. Клетки можно отделить от субстрата встряхиванием бутыли.

Антитела служат мощным инструментом, когда требуется охарактеризовать поверхностные белки (антигены) клеток, и могут быть использованы также для маркировки субпопуляции клеток. Особенно важное значение приобретают антитела, когда речь идет о специфических событиях, происходящих на поверхности клеток.

Главной проблемой является индукция антител, специфических к индивидуальным молекулам клеточной поверхности. Если антитела индуцируются иммунизацией особей одного вида клетками или субклеточными фракциями другого вида, то иммунный ответ оказывается сложным и антисыворотка требует значительного фракционирования и очистки.

При попытках обойти эту проблему было предложено (Koh-ler, Milstein, 1975, 1976) гибридизовать (гл. 13) клетки мыши-

ной миеломы с клетками селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами овцы. Гибридные клетки клонировали и отбирали клоны, секретирующие антитела к эритроцитам овцы. При слиянии клеток мышиной миеломы с клетками селезенки мышей, иммунизированных мембранами тимоцитов крысы, было выделено 5 клонов, продуцирующих различные антитела к ти-моцитам крыс (Williams et al., 1977).

10⁷ клеток, полученных из миеломы МОРС21 (Horibata, Harris, 1970), сливали с 10⁸ клеток селезенки с помощью полиэтиленгликоля (гл. 13), и слившиеся клетки разносили по 48 лункам пластинки для культуры ткани (пластинки Linbro BCL-5041; см. приложение 3). Клетки инкубировали в модифицированной Дюльбекко МСИ, содержащей 10% лошадиной сыворотки и HAT (разд. 13.5) в атмосфере воздуха с 10% С0₂. Среду из каждой лунки периодически тестировали с помощью радиоиммунологического теста на наличие антител к тимоцитам крысы и культуры, дающие положительную реакцию, клонировали, используя технику культивирования в полужидком агаре (разд. 8.1.4).

15.5. Дифференцировка мышечных клеток

Переход от делящихся миобластов к многоядерным мышечным волокнам представляет собой один из наиболее ярких примеров терминальной дифференцировки, которая может происходить in vitro. Биохимические изменения приводят к развитию электровозбудимой мембраны, сборке сократительного аппарата и появлению соответствующих ферментов. Более подробно с этим процессом можно ознакомиться в обзоре Букингэма (Buckingham, 1977).

Дополнительным фактором, привлекающим внимание к превращению миобластов в миотрубки, является синхронность, с которой дифференцировка происходит in vitro. Миогенез можно наблюдать в первичной культуре эмбриональных скелетных мышц (разд. 6.6), но он может быть также индуцирован в диплоидных линиях миобластов (Richter, Yaffe, 1970), позволяющих проводить отбор мутантов (гл. 13), резистентных к ядам или температурно-чувствительных по дифференцировке (Loomis et al., 1973; Somers et al., 1975). Были получены линии миобластов (Holtzer et al., 1975; Fiszman, Fuchs, 1975), трансформированных температурно-чувствительным-и вирусами (разд. 13.3 и 14.4). При пермиссивной температуре клетки этий линий непрерывно размножаются, но при повышении температуры индуцируется дифференцировка.

Миобласты могут дифференцироваться и сливаться без сопутствующего синтеза ДНК (Nadel-Ginard, 1978).

15.6. Дифференцировки жировых клеток

Из клеток ЗТЗ, исходно полученных из мышиных эмбрионов,, были выделены два клона (Todaro, Green, 1963; Green, Meuth,. 1974), которые в стационарной фазе накапливают большое количество триглицеридов в многочисленных цитоплазматических капельках. Стационарная фаза устанавливается, когда клетки достигают полного монослоя, но может быть синхронно индуцирована путем инокуляции суспензии трипсинизированных клеток в среду Игла, содержащую 20—30% сыворотки теленка и кар-боксиметилцеллюлозу (см. разд. 14.4.2).

Все клетки сохраняют при этом способность синтезировать-коллаген (т. е. остаются фибробластами), и лишь часть клеток в сериях различных субклонов действительно продуцируют ли-пиды, причем эта фракция клеток никогда не достигает 100% даже после нескольких недель культивирования клеток в стационарной фазе.

Способность клеток к индуцированному синтезу и запасанию триглицеридов подавляется при обработке пролиферирую-щих (но не покоящихся) клеток бромдезоксиуридином (5 мкМ). Это соединение, как известно, нарушает и другие системы дифференцировки (Rutter et al., 1973) в концентрации, не оказывающей влияния на скорость роста клеток.