Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

Клеточные культуры обладают многими преимуществами перед интактными животными, когда речь идет о включении радиоактивной метки и изучении действия лекарственных препаратов и гормонов. При использовании культур метка или лекарственный препарат могут быть добавлены и удалены в определенное время, их внеклеточная концентрация и удельная активность могут поддерживаться постоянными и, кроме того, на их метаболизм не будут влиять клетки других органов. Это не означает, конечно, что использование изотопов в культурах клеток лишено своих собственных подводных камней.

 

12.1. Определение скоростей синтеза ДНК

Определение скорости синтеза ДНК в популяции клеток или в индивидуальных клетках может потребоваться в качестве меры скорости роста клеток или при изучении клеточного цикла, или при непосредственном изучении метаболизма ДНК. Однако при добавлении тритированного тимидина к культивируемым клеткам возникает ряд проблем.

1. Для включения в ДНК тимидин должен пройти несколько последовательных этапов фосфорилирования:

Тимидин —> dTMP —ёТДР —- dTTP —- ДНК.

Для того чтобы включение тимидина отражало скорость синтеза ДНК, а не активность промежуточного фермента, лимитирующего скорость, клетки должны быть лишены барьера проницаемости, а различные киназы не должны быть скорость-лимитирующими компонентами этой цепи. Однако тимидилатки-назы отсутствуют в нерастущих клетках, а активность тимидинкиназы значительно изменяется в течение клеточного цикла (Stubblefield, Dennis, 1976). Следовательно, включение в клетки тимидина и его фосфорилирование могут быть скорость-лими-тирующими этапами в клетках — за исключением фаз S и G2. Действительно было показано, что вне этих фаз скорость вхождения тимидина очень низка (Adams, 1969а). В фазе S киназы перестают быть скорость-лимитирующими звеньями, а анализ

И*

Рис. 12.1. Уравновешивание ³Н-тимидина с кислоторастворимым пулом и его включение в ДНК. Мышиные клетки L929, растущие в чашках диаметром 5 см, инкубировали с ⁸Н-тимидииом (0,7 мкКи/мл; 5 мкМ) в течение указанного времени, после чего клетки быстро промывали три раза ледяным СБСР. Кислото-растворимый материал (КМ) экстрагировали холодной 5%-ной ТХУ и после промывки кислотой и этанолом клетки солюбилизировали в 0,3 н. NaOH и определяли включение в ДНК. [Перепечатано из (Adams, 1969а) с любезного

разрешения издателей.]

кислоторастворимого пула клеток на этой фазе выявил преобладание в нем dTTP (Gentry et al., 1965; Adams, 1969a).

2. Изменения в концентрации добавленного в среду тимидина могут влиять на его поглощение клетками, его фосфорили-рование и размер пула dTTP. В течение 10 мин после добавления тритированного тимидина в культуру клеток количество ³Н в кислоторастворимом пуле (внутриклеточные dTMP, dTOP и преимущественно dTTP) достигает равновесного уровня (рис. 12.1) (Gentry et al., 1965; Adams, 1969a). Очевидно, что существует равновесие между количеством образующегося ³H-dTTP и используемого для синтеза ДНК, но величина пула радиоактивных дезокситимидилатов определяется концентрацией внеклеточного тимидина (рис. 12.2). Это может достигаться сочетанием прямого усиления тимидинкиназы ее субстратом и ингибирования фермента под действием dTTP по механизму обратной связи (Ives et al., 1963). Размер пула остается по-

I_I_I_I_I_Г

.0 I 2 3 4 5

la [тимидин]- Ю⁸М

Рис. 12.2. Взаимосвязь между концентрацией внеклеточного тимидина и экзо-генно полученным ядерным пулом dTTP. Мышиные клетки L929 инкубировали 30 мин с ⁸Н-тимидином в указанной концентрации и экстрагировали кислото-растворимый пул клеток (см. рис. 12.1). При определении концентрации dTTP исходили из того, что вся радиоактивность кислоторастворимого пула представлена *H-dTTP и что этот нуклеотид локализован в ядрах клеток, находящихся в фазе S. Объем ядра принимали равным 500 мкм*. [Перепечатано из (Adams, 1969а) с любезного разрешения издателей.]

стоянным после достижения равновесия, пока не начнет снижаться внеклеточное содержание. Это происходит через несколько часов, если внеклеточная концентрация тимидина составляет lO-'M, и даже при концентрации 10-⁵М 10% тимидина может быть использовано в течение 24 ч. Так, если 10^е клеток удваиваются каждые 24 ч, то им требуется примерно

10^е-10/3 = 3,3-10^е пг тимидина=10⁴ пмоль тимидина.

Это означает, что если единственным источником тимидина является тимидин внеклеточной среды, то 5 мл среды с 10^-6М тимидином, содержащей 5-Ю³ пмоль тимидина, достаточно для поддержания экспоненциального роста 10^е клеток в течение менее чем 12 ч,

или t=Tcv/DN,

где t — время в часах до истощения тимидина, D — содержание 12—666

Рис. 12.3. Подавление роста клеток тимидином. Около 10⁵ клеток в 5 мл МСИ, в которую добавлены витамины и сыворотка теленка, высевали в чашки диаметром 5 см и инкубировали в присутствии указанных концентраций тимидина. Через 4 суток монослой клеток трипсинизировали и подсчитывали число клеток в счетчике. • L929; О HeLa ВНК; A BSC1;

хсно.

ДНК (пг/клетка), N — число клеток в миллионах, v — объем •среды в мл, с — концентрация тимидина в (нмоль/мл; мкМ) и Т—время генерации в часах.

Размер пула неограниченно растет при увеличении внеклеточной концентрации тимидина вплоть до 10 мМ (рис. 12.2), что указывает на огромный избыток внутриклеточных киназ (Cleaver, Holford, 1965; Gentry et al., 1965; Copper et al., 1966; Adams, 1969a; Stimac et al., 1977).

3. dTTP синтезируется также эндогенно. Этот путь включает в себя рибонуклеотид-редуктазу. Фермент находится под алло-стерическим контролем; одним из контролирующих элементов является dTTP, который в высоких концентрациях подавляет восстановление CDP и UDP, приводя тем самым к снижению размера пула dCTP. Это в свою очередь приводит к подавлению синтеза ДНК (рис. 12.3), причем это подавление снимается добавлением в ростовую среду дезоксицитидина в концентрации 5—10 мкМ (рис. 12.4). Подавление становится заметным, когда концентрация тимидина в ростовой среде превышает Ю^М, и полным при концентрации тимидина выше 3 мМ, что .лежит в основе одного из методов синхронизации клеток (см. гл. 10).

4. Эндогенно синтезируемый dTTP снижает удельную радиоактивность ³Н-ТТР, образующегося из добавленного ³Н-ти-.мидина. При добавлении тритированного тимидина в концентрации 3'10~⁸М большая часть тимина в новообразованной ДНК синтезируется эндогенно, или по пути de novo, но когда концентрация ³Н-тимидина в среде повышается до 0,3 мМ, то •юн оказывается источником более чем 90% тимина клеточной .ДНК (Cleaver, Holford, 1965; Cooper et al., 1966; Cleaver, 1967).

Рис. 12.4. Обращение дезоксицитиди-ном ингибирующего действия тимидина. Клетки СНО высевали в чашки Петри диаметром 5 см (0,13-10⁶ клеток в 5 мл МСИ, содержащей двойную концентрацию витаминов, 10% сыворотки теленка и пролин в концентрации 57,5 мг/л). Через 4 суток клетки собирали и просчитывали их количество в счетчике Коултера. #-# контроль; О-О

тимидин (3 мМ), присутствует в среде в течение всего времени инкубации. Указанные концентрации дез-оксицитидина использовались как в опытных, так и в контрольных чашках. Пунктиром показана начальная плотность клеток.

Поскольку удельная радиоактивность ³H-dTTP является одним из факторов, определяющих количество включающейся в ДНК радиоактивности (либо в общем количестве импульсов в минуту, либо в числе зерен серебра на радиоавтографах), и поскольку эта удельная радиоактивность может меняться в зависимости от концентрации тимидина в среде и от состояния клеток, то количественное определение скорости синтеза ДНК по включению ³Н-тимидина таит в себе множество подводных камней.

5. Концентрация эндогенного синтезируемого dTTP изменяется в течение клеточного цикла. Так, в покоящихся клетках и клетках, находящихся в фазе G1, пул dTTP невелик (около 3 пмоль/10⁶ клеток), но он увеличивается в течение фаз S и G2, достигая максимального уровня в митозе (Adams et al., 1971; Skoog et al., 1973; Walters et al., 1973). Этот dTTP локализован преимущественно в ядрах (Adams, 1969а; Adams et al., 1971; Skoog, Bjursell, 1974) и вызывает различной степени снижение удельной радиоактивности ³H-dTTP, образующегося из экзогенного ³Н-тимидина.

12.1.1. Решение проблемы

Существует три пути преодоления этих проблем: 1) насытить пул dTTP экзогенным ³H-dTTP;

2) блокировать эндогенный пул синтеза;

3) оценить вклад эндогенного dTTP в тимин ДНК.

12.1.1.1. Насыщение пула

При измерении включения тимидина в ДНК мышиных L-кле-ток при различных концентрациях ³Н-тимидина в среде оказалось, что при концентрации около Ю^-5 включение тимидина достигает плато (Cleaver, 1967). Аналогичные результаты были получены при использовании клеток СНО (рис. 12.5). Полу-

Рис. 12.5. Влияние концентрации тимидина на включение. Клетки СНО инкубировали с указанными концентрациями радиоактивного тимидина и определяли его включение в ДНК (более подробно см. подпись к рис. 12.6).

ченные результаты дают основание думать, что при этой концентрации тимидина (10^_5М) вклад эндогенного dTTP в тимин ДНК пренебрежимо мал. Следует обращать внимание, однако, чтобы вызываемое высокими концентрациями тимидина подавление рибонуклеотидредуктазы не приводило бы к ограничению поступления dCTP (разд. 11.8.3). Эксперименты лучше проводить с 5-10~⁵ или 10-10~^бМ тимидином в присутствии 5— 10 мкМ дезоксицитидина.

— Чашки диаметром 5 см, содержащие по 6-Ю⁵ клеток L929 в 5 мл МСИ с 10% сыворотки теленка и забуференной Hepes, инкубировать в течение ночи.

— Не давая клеткам охлаждаться, добавить 50 мкл раствора, содержащего ³Н-тимидин (50 мкКи/мкмоль) и дезоксицити-дин, до конечной концентрации соответственно 10^_4М (5 мкКи/мл) и 10-⁵М.

Пример

— Для поддержания температуры чашки следует хранить внутри увлажняемого контейнера в термостатированной (37 °С) комнате. После 60 мин прекратить включение, промывая клетки в чашках:

а) холодным СБСР (дважды),

б) холодной 5%-ной ТХУ (4 раза),

в) абсолютным этанолом (дважды).

— Высушить на воздухе и обработать клетки в 1 мл 0,3 н. NaOH, прогревая в случае необходимости до 37 °С.

— Перемешать содержимое чашки и перенести 0,5 мл во флакон для счета сцинтилляций.

— Нейтрализовать 0,1 мл 1,5 и. НС1 и добавить 6 мл толуоль-но-тритонового сцинтиллятора (0,5% дифенилоксазола в смеси толуола и тритона Х-100 в соотношении 2:1) и определить радиоактивность.

12.1.1.2. Блокирование эндогенного пути синтеза

Было показано (Stiegers et al., 1974), что в присутствии аметоптерина (10 мкМ), гипоксантина (30 мкМ) и глицина (100 мкМ) синтез ДНК может быть оценен по включению тритированного тимидина при концентрации последнего 3—30 мкМ. Скорость включения оказывается линейной, и оценки, основанные на удельной радиоактивности включающегося тимидина, совпадают с оценками количества синтезированной ДНК, полученными другими методами. Более того, присутствие аминоптерина не влияет на скорость пролиферации, продолжительность клеточного цикла и продолжительность фазы S.

Включение радиоактивности в ДНК в этих условиях происходит с постоянной скоростью в период между 30 и 90 мин после добавления антиметаболита и тритированного тимидина, и в течение этого периода удельная радиоактивность кислото-растворимого нуклеотидного пула остается постоянной и равной удельной радиоактивности ³Н-тимидина среды.

Пример

— Установить культуру клеток хомячка СНО в стеклянных сцинтилляционных флаконах (2-10^б клеток в 1 мл МСИ, содержащей 10% сыворотки теленка, гипоксантин (30 мкМ) и глицин (100 мкМ) и забуференной буфером Hepes).

— После культивирования в течение ночи добавить 50 мкл раствора аметоптерина (2-10^_5М) и тритированного тимидина (2-10-* М, 0,3 мкКи/мкмоль).

— Через 15 мин инкубации фиксировать клетки во флаконах в следующей последовательности:

а) промыть дважды холодным СБСР (5 мл),

б) промыть 4 раза холодной ТХУ (5 мл),

в) промыть дважды этанолом (5 мл),

г) промыть эфиром (5 мл) и высушить на воздухе.

— Растворить клетки в 0,3 мл гиамингидроксида (в случае необходимости прогреть при 60°С в течение 10 мин), добавить 5 мл толуольного сцинтиллятора (0,5% дифенилоксазо-ла в толуоле) и определить радиоактивность.

— Из радиоактивности после 90 мин инкубации вычесть радиоактивность, наблюдавшуюся после 30 мин инкубации, или просто определить радиоактивность после 60 мин инкубации* если включение было линейным, начиная с нулевого момента времени.

12.1.1.3. Оценка эндогенного дезокси dTTP (Adams, 1969b)

Главные проблемы в вопросе о насыщении пула связаны с предположением о том, что выбранные концентрации тимидина

а) достаточно велики, чтобы насытить пул, и вместе с тем

б) достаточно низки, чтобы не оказать повреждающего действия на рост клеток.

Скорость включения радиоактивности зависит от удельной радиоактивности ³H-dTTP, которая, согласно двум предыдущим методам, предполагалась равной удельной радиоактивности экзогенного ³Н-тимидина. При увеличении концентраций ³Н-тими-дина от низких значений (менее Ю^-6 М) увеличиваются также' удельная радиоактивность пула ³H-dTTP и включение радиоактивности в ДНК. Эти изменения происходят на фоне неизменной истинной скорости синтеза ДНК. Следовательно, часть пула dTTP, содержащего радиоактивность [³H-dTTP]/([dTTP] -f -f [³H-dTTP]) равна части содержащего радиоактивность тимина в ДНК (³Н-тимин/общий тимин).

Это равенство может быть записано в следующем виде:

1 _ [dTTP] .1.1 ³Н-тимин Обший тимин "Т" ³H-dTTP 'Общий тимин*

Это уравнение описывает прямую линию, пересекающую ось ординат в точке, представляющей собой обратную величину скорости синтеза ДНК. Более того, при равенстве эндогенного и экзогенного пулов трифосфата (dTTP и ³H-dTTP) скорость включения трития оказывается полумаксимальной, что позволяет вычислить величину пула эндогенного dTTP. В основе всех этих рассуждений лежит предположение о том, что пул кисло-торастворимых дезокситимидилатов состоит преимущественно из dTTP.

Пример

— Установить культуру мышиных клеток L929 на покровных стеклах в культуральной пластинке с 24 лунками. В каждую

лунку внести 2-Ю⁵ клеток в 0,5 мл среды Игла с 10% сыворотки теленка и инкубировать в течение ночи.

— В каждую лунку добавить 10 мкл раствора, содержащего 2 мкКи ³Н-тимидина в следующих концентрациях: 25 мкМ, 50, 100, 200, 300, 500, 700 мкМ и 1 мМ.

— Инкубировать 60 мин, после чего извлечь покровные стекла и промыть их, окуная последовательно в три сосуда с ледяным СБСР.

— Поместить покровные стекла в сцинтилляционные флаконы, добавить в каждый по 0,5 мл холодной 5%-ной ТХУ и оставить на 10 мин.

— Извлечь покровные стекла и промыть последовательно в 4 сосудах с 5%-ной ТХУ и двух сосудах с абсолютным этанолом.

— Поместить покровные стекла в свежие сцинтилляционные флаконы, добавить по 0,3 мл гиамингидроксида для раство-

Рис. 12.6. Доступность эндогенного dTTP. 10⁵ клеток СНО в 0,5 мл МСИ (модификация Глазго), дополненной пролином и 10% сыворотки теленка, вносили в каждую лунку пластинки для культуры клеток. Около половины клеток прикрепляются к покровным стеклам в лунках, и, судя по результатам радиоавтографического анализа, 30% клеток синтезируют ДНК. В каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкКи ⁸Н-тимидина, так, чтобы конечная концентрация тимидина варьировала в пределах от 0,1 до 15 мкМ. После 40 мин инкубации при 37 °С покровные стекла с клетками удаляли и определяли включение радиоактивности в ДНК и в кислоторастворимый материал (dTTP). Строили график зависимости обратных значений этих величин и через экспериментальные точки проводили прямую методом наименьших квадратов. Коэффициент корреляции составляет 0,99. Пересечение прямой с осью ординат дает скорость включения тимидина в ДНК (8,9 пмоль/40мин)/ /5-Ю⁴ клеток или (0,97 мкг ДНК/ч)/10^е клеток в фазе S. Исходя из размеров тритированного кислоторастворимого пула при полумаксимальном включении, можно рассчитать размер пула эндогенного dTTP (62,5 пмоль/10⁸ клеток). При объеме 10^е ядер, равном 0,1 мкл, это соответствует концентрации 0,63 мМ.

рения клеток и затем по 5 мл толуольного сцинтиллятора и определить радиоактивность ³Н-тимина в ДНК.

— К экстракту холодной ТХУ со стадии 4 добавить 5 мл толу-ольно-тритонового сцинтиллятора для измерения включения; трития в кислоторастворимый пул (³Н-ТТР).

— Полученные результаты (имп./мин) перевести в распады/мин и затем в пикомоли, принимая во внимание изменяющуюся удельную радиоактивность тритированного тимидина.

— Построить зависимость обратной концентрации ³Н-тимина от обратной концентрации ³H-dTTP и экстраполировать к оси ординат для получения полного значения обратных концентраций тимина (рис. 12.6). Точка на оси абсцисс, соответствующая двойному содержанию общего тимина, представляет собой количество эндогенно синтезируемого dTTP в клетках.

Известен также кинетический подход к оценке размеров пула ДНК (Wittes, Kidwell, 1973). В этом случае клетки непрерывно инкубируют с 10 мкМ тритированного тимидина до тех пор, пока не будут мечены 20% остатков тимидина в ДНК. При этой концентрации клеток L929, растущих в суспензии, превращение внеклеточного тимидина в dTTT в фазе S составляет 9,5 пмоль/мин на 10⁶ клеток.

12.1.1.4. Сравнение методов

Ни один из методов нельзя считать полностью удовлетворительным. Первые два метода включают в себя добавление агентов, предназначенных изменять метаболизм клеток, а третий метод непригоден для радиоавтографического анализа. Тем не менее каждый из методов является попыткой решения проблем, которыми многие исследователи зачастую пренебрегают.

12.1.2. Применение к суспензионным культурам

При работе со суспензионными культурами промывание клеток кислотой следует проводить путем повторного центрифугирования, но это трудоемко и может приводить к потере клеточного материала, если не принять необходимых мер предосторожности. Вместо этого можно осадить клетки на стеклянные или ацетатцеллюлозные фильтры, установленные в держателях фильтров для микроанализа (Millipore Corp. Ltd.), либо осажденные центрифугированием клетки можно растворить в небольшом известном количестве 0,3 н. NaOH. Аликвоты растворенных клеток высушивают затем на бумажных дисках Ватман 5 ММ диаметром 2,5 см и сразу несколько дисков проводят через сосуды с 5%-ной ТХУ (4 раза), этанолом (дважды) и эфиром.

Клеточный материал на бумажных и стеклянных фильтрах можно затем растворить с помощью гиамингидроксида и его радиоактивность определить в толуольном сцинтилляторе.

J2.2. Оценка скоростей синтеза РНК и белка

В качестве специфического предшественника РНК используется обычно 5-³Н-уридин, но при этом значительная часть радиоактивности может включаться в ДНК, особенно в форме цитр* зина (Adams, 1968; Oldham, 1967). Многие проблемы, рассмотренные нами при анализе включения ³Н-тимидина, возникают также и при использовании ³Н-уридина, но в этом направлении лроведено очень мало скрупулезных исследований.

Синтез белка исследуют обычно с помощью радиоактивных аминокислот. Процедура, как правило, сходна с той, которая используется для изучения синтеза ДНК, но в первом случае ростовая среда клеток уже содержит высокие концентрации аминокислот, так что добавляемые радиоактивные аминокислоты служат маркерами, не нарушая нормального роста клеток. Однако, когда бывает необходимо увеличить включение радиоактивности, присутствие в среде немеченых аминокислот может этому мешать, и их концентрация должна быть снижена. Сильное снижение концентрации оказывает на клетки явное повреждающее действие (разд. 11.7), так что следует провести предварительный анализ минимальной концентрации аминокислоты, к которой клетки будут толерантны в данных экспериментальных условиях.

Если мышиные клетки L929 пересеять из стационарной культуры в среду без метионина, то клетки не вступают в фазу S, и даже 10%-ная по сравнению с нормальной концентрация метионина может оказывать серьезное действие (Turmbull, Adams, 1975). Если же клетки вступили в фазу S, то синтез ДНК может продолжаться при фактическом отсутствии метионина, но ДНК и, по-видимому, другие синтезируемые полимеры будут недостаточно метилированы.

Было показано (Taylor, Stanners, 1967), что крупные полирибосомы начинают дезагрегировать в течение 10 мин после •снижения концентрации валина в среде до 5% от нормальной. Это приводит к снижению скорости синтеза белка, измеряемой с использованием многих меченых аминокислот. Следовательно, хотя при том же расходе меченой аминокислоты включение радиоактивности при использовании недостаточной среды может возрастать, в пересчете на молярную концентрацию оно будет снижаться.

12.3. Радиоавтография

р-Частицы, возникающие при распаде трития, обладают низкой энергией и поэтому идеально подходят для радиоавтографии высокого разрешения. Зерна серебра обычно располагаются на расстоянии 0,1—0,5 мкм от источника р-частиц трития, тогда как в случае р-частиц ¹⁴С это расстояние достигает 290 мкм (Cleaver, 1967). Действительный диапазон зависит от энергии отдельной р-частицы и плотности материала, через который она проходит, так что ¹⁴С может быть использован только в тех случаях, когда требуемое разрешение ниже 20 мкм.

Обеспечивая высокое разрешение, низкая энергия р-частиц трития создает свои проблемы. Толщина фиксированных клеток оказывается, как правило, не ниже 2 мкм, так что только часть испускаемых р-частиц проходит через клетку и достигает радиоавтографической эмульсии. В результате самопоглощения р-частиц клетками и вследствие того, что по крайней мере половина р-частиц испускается в направлении, противоположном эмульсии, на образование каждого зерна серебра в эмульсии приходится около 19 распадов ядер трития (Cleaver, Holford, 1965).

р-Частицы, испускаемые под углом и проходящие через более толстый слой биологического материала, никогда не достигают эмульсии. Одно из преимуществ низкоэнергетических р-частиц трития заключается в том, что эти частицы, достигая эмульсий с повышенной плотностью, задерживаются в ней на расстоянии 0,15—1 мкм. Следовательно, при эмульсиях толще 1 мкм их толщина не оказывает существенного влияния на чувствительность (Doniach, Pelc, 1950).

С другой стороны, высокая энергия р-частиц, испускаемых ¹⁴С, обеспечивает их прохождение через эмульсию в среднем на 10 мкм, так что увеличение толщины эмульсии, снижая разрешение, увеличивает число образующихся зерен серебра. Это делает возможным применение метода двойной метки, когда ДНК клеток метят ³Н- и ¹⁴С-тимидином и покрывают двумя слоями эмульсии (Baserga, 1961; Dawson et al., 1962). Нижний слой содержит зерна, «засвечиваемые» р-частицами как от ³Н, так и от ¹⁴С, но только последние могут «засвечивать» зерна в верхнем слое. Фокусируя объектив микроскопа на тот или иной слой, можно выявить клетки, меченные только ¹⁴С. С помощью этого метода измеряли вступление клеток в фазу S и выход из этой фазы (Lala, 1968).

12.3.1. Эмульсии

Чувствительность и разрешение радиоавтографического метода зависят от используемой эмульсии. Эмульсии поставляются в двух формах: а) в форме геля, который необходимо расплавить

и развести перед обмакиванием в него препаратов и б) в виде заранее приготовленных пленок, которые следует отделить от •стеклянных пластинок, поместить на поверхность воды и перенести на препарат. К первой форме относятся эмульсии Илфорд L4 и Кодак NTB3, а ко второй — эмульсия Кодак AR10 (приложение 3). Размер зерен в этих эмульсиях варьирует от 0,12 мкм (Илфорд L4) до примерно 0,4 мкм (Кодак AR10), и каждая р-частица, проходя через эмульсию, может образовывать от 0,5 зерен (пленки Кодак) до 1,3 зерен (Илфорд L4) (Саго, 1966). Использование отделяемых пленок широко распространено, но этот метод более трудоемок, требует большей затраты времени и часто не дает каких-либо значительных преимуществ при тритиевой радиоавтографии. Вместе с тем постоянство толщины пленок является важным преимуществом при количественной радиоавтографии соединений, меченных ¹⁴С.

12.3.2. Отделяемые пленки

1. Покровные стекла с растущими на них мечеными клетками монтируют клетками вверх на предметном стекле, используя клей DePex (Gurr; приложение 3). Для улучшения результатов предметные стекла следует предварительно окунуть в 0,5% -ный раствор желатина, содержащий 0,05% хромоалума, и высушить на воздухе.

2. Все следующие работы следует проводить в темной комнате, используя безопасный красный свет.

3. Пластинки с отделяемой пленкой (12,1x16,5 см) нарезать с помощью острой бритвы. Полосы шириной 1 см с каждой

стороны пластины отбросить, а среднюю часть разрезать на 8 квадратов.

4. Через несколько минут после разрезания кусочки отделяемой пленки сворачиваются. Их следует удалить с помощью скальпеля и корнцанга и расправить на поверхности чистой дистиллированной воды при 20 °С.

-5. Выдержать пленки в течение трех минут. За это время пленки набухают и расплавляются.

6. Погрузить предметные стекла с клетками под воду и поднять их таким образом, чтобы пленка оказалась над клетками. Свисающие концы пленки пристают к нижней поверхности стекла.

7. Промыть и высушить в струе холодного воздуха.

8. Экспонировать и проявить, как указано ниже. Главной трудностью при использовании отделяемых пленок является

возможность их смещения относительно препарата в ходе подготовки. Этого можно избежать, обеспечив адекватное набухание (стадия 5) и высушивание.

12.3.3. Жидкая эмульсия

1. Смонтировать покровные стекла с клетками на предметном стекле, как указано выше. В использовании покрытых желатиной стекол необходимости нет.

2. В темной комнате расплавить эмульсию, помещая бутыль с гелем в водяную баню при 40 °С. Этот процесс довольна

длителен, и его не следует часто повторять с одним и тем же препаратом эмульсии. Поэтому следует внести по 5—Юг твердого геля в отдельные универсальные флаконы и хранить их отдельно, расплавляя по мере надобности эмульсию в одном из флаконов.

3. Разбавить жидкую эмульсию одним или двумя объемами дистиллированной воды. Избегать встряхивания и интенсивного перемешивания в связи с опасностью образования пузырьков.

4. Погрузить препараты в разведенную эмульсию. Если покровное стекло смонтировано на конце предметного, то глубина погружения в жидкую эмульсию может не превышать 2—3 см.

5. Дать стечь избытку эмульсии и высушить препараты в токе холодного воздуха. Высушивание в горизонтальном положении приводит к образованию более толстого слоя эмульсии. При использовании более разведенных эмульсий высушивание в вертикальном положении позволяет получать слои эмульсии толщиной менее 1 мкм.

6. Радиоавтографы лучше экспонировать в светонепроницаемом ящике в течение 3—7 дней. Сообщалось, что более длительное экспонирование приводит к диссипации латентного изображения, если только не хранить высушенные радиоавтографы при низкой температуре в бескислородной атмосфере. Для этого в светонепроницаемый ящик с радиоавтографами помещают пенал с влагопоглотителем и кусок сухого» льда. После этого ящик обматывают липкой лентой и хранят в холодильнике.

Примечание. Обратить внимание, чтобы в том же холодильнике не хранились источники высокоэнергетического излучения, например ³²Р. Если толщина эмульсионного слоя превышает 1 мкм, то число зерен серебра в нем линейно увеличивается в течение 9 сут, даже если препараты хранятся при комнатной температуре в атмосфере воздуха (рис. 12.7). 7. После экспонирования инкубировать предметные стекла в проявителе Кодак D19b при 20 °С в течение 3—5 мин. Этот проявитель можно изготовить, растворяя следующие вещества в указанном порядке: 2,2 г метола (Ilford Std., приложение 3); 144 г гидрохинона; 48 г безводного карбоната натрия; 4,0 г бромида калия.

Рис. 12.7. Влияние продолжительности экспонирования при радиоавтографии на число зерен. Клетки ВНК21/С13, меченные ³Н-ури-дииом, покрывали эмульсией II-ford L4 (разведенной равным объемом дистиллированной воды). Стекла с клетками высушивали в горизонтальном положении и экспонировали на воздухе при комнатной температуре в течение указанного времени. (Печатается с разрешения К. Shaw и J. D. Pitts.)

Довести объем раствора до 1 л дистиллированной водой и хранить при 4°С в ПОЛНОСТЬЮ (для предотвращения окисления) заполненной бутыли. Перед употреблением убедиться, что проявитель прогрет до 20 °С.

8. Фиксировать фиксажем Amfix (May and Baker; приложение 3), разведенным двумя частями воды, в течение 5 мин или в течение времени, вдвое превышающего время проявления, и промыть проточной водой.

9. Окрасить по Гимза в течение 3 мин и тщательно промыть проточной водой. Высушить на воздухе.

10. Заключить препарат под второе чистое предметное стекло, используя DePex. Если мечение не очень интенсивное, рекомендуется использовать масляную иммерсионную оптику.

12.3.4. Радиоавтография в чашках

Клетки, выращенные непосредственно в чашках (чашки Петри диаметром 5 см), могут быть мечены радиоактивным предшественником и фиксированы так же, как и клетки на покровных стеклах. Затем в каждую чашку добавляют 1 мл разведенной эмульсии и препараты экспонируют (без крышки) и проявляют, как указывалось выше.

12.3.5. Значимость подсчета числа зерен

Радиоавтографический анализ — единственный метод, с помощью которого можно определить долю клеток, включающих радиоактивный предшественник, и локализацию этого включения. Так, тритированный тимидин включается в ДНК ядер клеток, находящихся в фазе S, а тритированный гипоксантин появля-

ется вначале в ядрах, а затем в цитоплазме клеток с активностью гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, но не в мутант-'ных клетках, лишенных этого фермента (разд. 13.1).

Подсчет числа зерен как количественный показатель скорости или интенсивность того или иного процесса, например синтеза ДНК, обладает многими из тех недостатков, которые отмечались для измерения общего включения радиоактивности в культивируемые клетки (разд. 12.1). Так, включающийся ³Н-тимидин разводится эндогенным dTTP, пул которого может быть различен у разных клеток. Кроме того, отсутствие точной зависимости между числом распадов и числом зерен означает, что по количеству зерен в лучшем случае можно определить лишь относительную скорость синтеза макромолекул. Тем не менее подсчет числа зерен является единственным путем сравнения скоростей включения предшественника в индивидуальные клетки.

Инкубация клеток с ³Н-тимидином позволяет определить не только относительное число клеток, участвующих в синтезе ДНК. Оказывается, что число зерен над клеткой варьирует в весьма широких пределах — более широких, чем можно было бы ожидать на основании статистического распределения. На рис. 12.8 показано распределение числа зерен сравнительно с

Рис. 12.8. Распределение числа зерен. L-клетки метили в течение 10 мин ³Н-тимндином (2,5 мкКи/ /мл; 0,36 Ки/ммоль) и готовили для радиоавтографического анализа с эмульсией NTB3. По дочитывались клетки, над которыми обнаружилось 1 или более зерен серебра (62% всех клеток). Для сравнения показано распределение Пуассона со средним 30. [Перепечатано из (Cleaver, 1967) с любезного разрешения автора.]

распределением Пуассона со средним значением 30 зерен на клетку. Уширение распределения частично обусловлено клетками, выходящими из фазы S или вступающими в эту фазу в период мечения, но число таких клеток может быть снижено сокращением времени мечения. Другой причиной уширения распределения числа зерен является неравномерность скорости синтеза ДНК во время фазы S (разд. 10.3), а изучаемые популяции содержат клетки на всех стадиях синтеза ДНК.

12.3.6. Фоновое число зерен

На рис. 12.8 отчетливо выявляется группа «немеченых» клеток. Такие клетки содержат обычно менее чем одно зерно (в среднем) на клетку, и такое же число зерен обнаруживается над соответствующими участками предметных стекол, не содержащими клеток. Общепринято рассматривать число зерен над такими контрольными участками в качестве меры фонового счета.

Повышенный фоновый счет обнаруживается, когда 1) используется старая эмульсия, либо радиоавтографы экспонируются вблизи радиоактивных источников, таких, как ³²Р; 2) увеличивается время экспозиций; 3) имеет место неадекватное удаление тритированных предшественников или кислотораствори-мых компонентов,

12.3.7. Радиоавтография водорастворимых ,„ компонентов

В приведенных выше методах молекулы радиоактивных предшественников и кислоторастворимых промежуточных продуктов тщательно удаляли, чтобы снизить фоновое число зерен, обеспечив тем самым определение истинного включения радиоактивности в макромолекулы. Однако разработано несколько процедур для визуализации локализации водорастворимых компонентов внутри клеток. Начальным этапом всех этих методов является эффективное удаление внеклеточного радиоактивного материала путем интенсивной промывки клеток солевыми растворами. Неясно, однако, насколько такое промывание удаляет внутриклеточный материал, способный диффундировать из клеток в этих экспериментальных условиях. Так, в клетках, трижды промытых ледяной СБСР Игла, остается мало тритированного тимидина. Это может означать либо 1) отсутствие внутриклеточного тимидина, либо 2) быструю диффузию тимидина из клеток при промывке их СБСР. Следовательно, описанные ниже радиоавтографические процедуры могут обнаруживать заряженные молекулы, которые обычно выделяются из клеток лишь кислыми фиксаторами, например тимидинфосфаты, глюкозофос-фаты и так далее.

12.3.7.1. Фиксация клеток

Выбор метода фиксации зависит главным образом от того, требуется ли установить точную локализацию предшественников, либо допустима или желательна некоторая диффузия растворимых компонентов. В последнем случае быстрое высушивание на воздухе (при 37 °С) клеток, меченных тритированным тими-

дином, позволяет тритированным тимидинфосфатам диффундировать на короткое расстояние, образуя ореол вокруг ядер (Adams, 1969а). Для точной локализации необходимо заморозить клетки в изопентане или фреоне, поддерживаемых при температуре жидкого азота, и затем лиофилизовать клетки. Процесс такого высушивания очень быстр вследствие малого размера клеток. Лиофилизацию можно осуществить, расположив предметное стекло с клетками на металлическом бруске, охлажденном до температуры жидкого азота, и поместив этот брусок в вакуумный эксикатор, подсоединенный к вакуумному насосу. Согласно другому методу, предметные стекла с клетками помещают в колбу, охлаждаемую смесью соли со льдом до —20 °С и соединенную с вакуумным насосом. В обоих случаях в системе должна присутствовать ловушка, охлаждаемая смесью метанол/сухой лед, для улавливания паров воды.

Вместо лиофилизации может быть проведено замещение замороженных клеток (Pease, 1953). После обработки клеток изо-пентаном при температуре жидкого азота их промывают несколькими сменами абсолютного метанола при температуре твердого СОг в течение 2—3 ч.

12.3.7.2. Покрытие эмульсией

И в этом случае, если допустима некоторая диффузия, предметные стекла с фиксированными клетками погружают в жидкую эмульсию и быстро высушивают в горизонтальном положении (Adams, 1969а). Высушивание в вертикальном положении приводит к появлению хвостов зерен, направленных от клеток, что объясняется вымыванием растворимых радиоактивных соединений жидкой эмульсией.

Фитцджеральд и др. (Fitzgerald et al, 1961) охлаждали фиксированные стекла в рефрижераторе, так что после переноса их в теплую темную комнату на поверхности стекол образовался слой конденсата. Этого слоя оказывается достаточно, чтобы удержать квадрат сухой отделяемой пленки, прижав его большими пальцами рук. Фиксированная на этой стадии пленка обычно набухает в ходе проявления, что приводит к заметному сдвигу пленки относительно клеток.

Чтобы избежать проблемы ненабухающей отделяемой пленки и снизить до минимума диффузию, к фиксированным стеклам можно добавлять частично высушенную жидкую эмульсию (Miller et al., 1964а; Finbow, Pitts, 1979).

— Поместить небольшое количество разбавленной жидкой эмульсии в чашку Петри диаметром 9 см при 44 °С и дать ей охлаждаться, пока она не станет застывать.

— Опустить в эмульсию проволочную петлю диаметром около 8 см и вынуть ее вместе с захваченной эмульсией.

— Поместить петлю на предметное стекло, лежащее на горизонтальной поверхности. Эмульсия образует четкий круг вокруг стекла.

— Высушить в токе холодного воздуха и обработать, как указано выше.

12 А. Репарация ДНК

Включение тритированного тимидина в ДНК в результате репарации редко оказывается существенным при изучении синтеза ДНК. Однако после облучения или в присутствии некоторых ядов, подавляющих репликацию ДНК, главной причиной включения тритированного тимидина может стать репарация поврежденной ДНК.

Репарацию ДНК лучше изучать в системах с низким фоновым уровнем репликации. Подходящими системами являются культуры, достигшие стационарной фазы при высокой плотности, или препараты нестимулированных лимфоцитов, в которых менее 1% клеток находится в фазе S. Низкий уровень репли-кативного включения может быть еще более подавлен гидроок-симочевиной (1—2мМ),избирательно подавляющей репликацию {Cleaver, 1969b). Избирательность действия, возможно, объясняется просто очень малым пулом дезоксирибонуклеозидтри-фосфатов, требующихся для репаративного синтеза.

Тот факт, что наблюдающееся в этих условиях включение объясняется репарацией ДНК, можно подтвердить мечением ³Н-бромдезоксиуридином в присутствии 1 мкМ фтордезоксиури-дина и гидрооксимочевины. Если ДНК затем выделить и фракционировать равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия, то метка обнаруживается в легкой незамещенной цепи (Cleaver, 1969а; Abo-Darub, 1977).

12.4.1. Ультрафиолетовое облучение

Подготовленные для облучения клетки должны образовывать монослой на пластиковой (прозрачной для ультрафиолета) чашке или бутыли в минимальном объеме ФСБ-А или другой жидкости, не поглощающей ультрафиолетовых лучей. Клетки подвергаются действию света с длиной волны 254 нм при дозе около 0,5 (Дж/м²)/с на соответствующем расстоянии от источника (Abo-Darub et al., 1978). Энергию эмиссии источника можно определить с помощью химического актинометра (Hatchand¹, Parker, 1956), принцип действия которого заключается в том,, что облучение раствора ферриоксалата калия приводит к высвобождению ионов железа в количестве, пропорциональном дозе ультрафиолетового облучения.

После облучения в культуры добавляют ростовую среду и культуры быстро возвращают в термостат.

12.4.2. Измерение репаративного синтеза

Прометить клетки ³Н-тимидином (5 мкКи/мл, 20 Ки/ммоль) в присутствии 1—2 мМ гидроксимочевины. После периода мечения определить включение метки в ДНК, как указывалось выше, либо подготовить клетки для радиоавтографического анализа; в этом случае нет необходимости в присутствии гидроксимочевины, поскольку клетки, находящиеся в фазе S, легко отличимы по очень высокому числу зерен. В культурах необлучен-ных клеток обнаруживается менее 0,2 зерен на клетку, а в культурах, облученных дозой около 5 Дж/м², обнаруживается 15— 20 зерен на клетку после 8-дневной экспозиции (Abo-Darub et al., 1978). На рис. 12.9 показана динамика репарации облученных лимфоцитов, полученных от здоровых людей и от больных с лучевым кератозом (заболевание, часто встречающееся в некоторых регионах, при котором образуются опухоли на участках кожи, открытых солнцу). В лимфоцитах больных с лучевым кератозом скорость репарации ДНК ниже, чем в нормальных лимфоцитах.

< Синхронизация клеток		Клеточные мутанты и гибридные клетки >