Клеточные мутанты и гибридные клетки

Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

Главное преимущество бактерий для биохимического анализа — это доступность мутантных штаммов в сочетании с коротким временем генерации. Культивируемые клетки животных обладают относительно малым временем генерации по сравнению с самими животными, так что основные попытки были направлены на получение и отбор мутантных животных клеток и их использование при изучении генетики соматических клеток.

13.1. Луксотрофные мутанты

В 1968 г. был предложен общий Метод получения ауксотрофных мутантов (Као, Puck, 1968). В основе этого метода лежали данные о том, что ДНК, содержащая 5-бромдезоксиуридин {BUdr), становится чувствительной к видимому свету флуоресцентной лампы. Эта чувствительность может быть использована для избирательной гибели прототрофов, растущих в рестрик-тивной среде, т. е. в среде, ограничивающей рост ауксотрофных или иных мутантов. Клетки, которые после обработки могут расти в полной среде, представляют собой ауксотрофных мутантов. Ниже приведены последовательные этапы получения ауксотрофных мутантов.

— Выращивать клетки в обогащенной среде, содержащей мутаген М-метил-М'-нитро-Ы-нитрозогуанидин (МННГ) в концентрации 0,5 мкг/мл или этилметансульфонат (ЭМС) в концентрации 200 мкг/мл в течение 16 ч.

— Перенести клетки в лишенную мутагенов обогащенную среду и инкубировать в течение нескольких генераций в условиях, обеспечивающих рост как прототрофов, так и мутантных ауксотрофов.

— Сменить полную ростовую среду на минимальную ограничивающую среду и инкубировать в течение времени, достаточного для истощения пула незаменимых метаболитов.

— Добавить в культуру BUdr (10^_6М). BUdr включается в ДНК прототрофов, которые являются единственными клетками, растущими в минимальной ограничивающей среде.

— После двух клеточных генераций удалить BUdr и экспонировать клетки в течение 30 мин в свете флуоресцентной лампы 40В «Cool White* (General Electric). Это приводит к гибели прототрофов.

— Перенести клетки в полную обогащенную ростовую среду,, обеспечивающую появление клонов ауксотрофных клеток через 1—2 недели.

13.2. Отбор мутантов

Мутанты, дефектные по тому или иному ферменту, могут быть отобраны при наличии двух условий: фермент не является незаменимым, а включение аналога природного субстрата приводит к летальному исходу.

Клетки, лишенные тимидинкиназы (клетки ТК~), можно выделить, обработав клеточные культуры высокими концентрациями (30 мкг/мл) 5-бромдезоксиуридина, который убивает клетки, содержащие фермент тимидинкиназу, в результате включения в клеточную ДНК большого количества аналога.

Мутанты, лишенные тимидинкиназы или с резко сниженной активностью фермента, могут служить примером клеток, для которых тимидинкиназа не является незаменимой. Клетки могут синтезировать dTMP из dUMP, используя фолиевую кислоту в качестве донора одноуглеродного фрагмента (рис. 13.1).

Рис. 13.1. Синтез dTMP. а—тимидинкиназа; б — дигидрофолятредуктаза.

Аналогичным путем мутанты, лишенные гипоксантин-фосфо-рибозилтрансферазы (ГФРТ), могут быть выделены путем выращивания клеток в присутствии 8-азагуанина (3 мкг/мл). Этот аналог гуанина включается в пул пуриновых нуклеотидов, а следовательно, и в нуклеиновые кислоты под действием фос-форибозилтрансферазы, которая в норме участвует во включении гипоксантина или гуанина. И в этом случае выживают му-тантные клетки, лишенные этого фермента. Фермент не является незаменимым, поскольку IMP может синтезироваться эндо-

Рис. 13.2. Синтез IMP. с — гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза (ГФРТ); ГАР — глицинамидрибонуклеотид; ФГАР — формилглицинамидрибонуклеотид; ФРПФ — фосфорибозилпнрофосЛат; АИКАР — 5-аминоимидазол-4-карбокси-амидрибонуклеотид. H4F0I — тетрагидрофолиевая кислота.

генно из более мелких субстратов. Два этапа эндогенного пути синтеза IMP используют фолиевую кислоту в качестве одноуг-леродного донора для растущего пуринового кольца (рис. 13.2).

Аминоптерин и аметоптерин (метотрексат) представляют собой 4-аминозамещенные аналоги фолиевой кислоты (рис. 13.3). Эти соединения подавляют образование активных промежуточных продуктов, блокируя фермент дигидрофолятредуктазу (реакция б) и разрывая таким образом цикл (рис. 13.4).

Можно было бы ожидать, что действие антифолятов должно' приводить к накоплению дигидрофолиевой кислоты, но это оказалось не так (McBurney, Whitmore, 1975), в связи с чем было-высказано предположение о том, что антифоляты могут оказывать прямое ингибирующее действие как на фолят-зависимые ферменты, участвующие в биосинтезе пуринов, так и на тими-дилат-синтётазу. Однако при выращивании клеток в присутствии возрастающих концентраций аминоптерина были выделены несколько резистентных клеточных линий (Hakala, Ishihara, 1962; Littlefield, 1969). Эти линии клеток характеризовались либо измененной проницаемостью, либо измененной фолятредук-тазой, либо увеличенной скоростью синтеза, а следовательно, и активностью фермента (Alt et al., 1976), что было вызвано, по крайней мере частично, избирательной амплификацией гена дигидрофолятредуктазы (Alt et al., 1978; Schimke et al., 1978). Более подробно эта проблема рассматривалась в разд. 11.8.1. Важная роль антифолятов в технике НАТ-отбора (разд. 13.5) была использована (Littlefield, 1964) для выделения гибридов между мутантными клетками, дефектными, с одной стороны, ш> тимидинкиназе и с другой —по ГФРТ (см. ниже). Антифоляты

Фалиевпя кислота

I MP и другие пуриновые нуклеотиды

Рис. 13.4. Взаимопревращения производных тетрагидрофолиевой кислоты. H₂Fol — дигидрофолиевая кислота, H4F0I — тетрагидрофолиевая кислота; АИКАР — 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибонуклеотид; Ф-АИКАР — фор-гмил-АИКАР; Г АР — глицинамидрибонуклеотид; ФГАР — формил-ГАР; Glu — глутаминовая кислота; ФИ-Glu — формиминоглутаминовая кислота. {Модифицировано из (Mudd, Cantoni, 1964).]

использовались также для подавления эндогенного пути при мечении клеток радиоактивными тимидином или гипоксантином (разд. 12.1.1.2), для синхронизации клеток истощением тимидинового пула (разд. 11.8.1) ив клинике для химиотерапии рака.

13.2.1. Процедура выделения ТК~--мутантов (Littlefield, Basilico, 1966)

— Посеять 5-Ю⁵ клеток ВНК21/С13 в чашки диаметром 100мм в среде Игла в модификации Дюльбекко, содержащей 10% сыворотки теленка, 10% триптозофосфата и бромдезоксиуридин в концентрации 3,3 мкг/мл. Это приводит к гибели большинства клеток в течение 10 суток и лишь около 20 клеток выживают и могут образовывать колонии.

— Собрать клетки и высеять их аналогичным образом, но при концентрации бромдезоксиуридина 30 мкг/мл. Это приводит к отбору высокорезистентных мутантов.

Через 10 дней образуются следующие 20 или около того клонов, у которых активность тимидинкиназы составляет 1—3% таковой в исходных клетках и которые характеризуются включением ¹⁴С-тимидина в ДНК на уровне 5—7% от исходного.

13.3. Температурочувствительные мутанты

Общий метод выделения температурочувствительных мутантов (ts-мутантов) заключается в инкубации мутагенизированных клеток с агентом, оказывающим летальное действие на клетки, делящиеся при непермиссивной температуре. В качестве непер-мессивной температуры обычно выбирается 39 °С, но температура 37,5 °С часто бывает более удобной для снижения числа «слабых» (leaky) мутантов, т. е. мутантов, имеющих высокую частоту реверсий к нормальному фенотипу (Basilico, 1977, 1978; Talavera, Basilico, 1977).

К летальным агентам относятся соединения, индуцирующие несбалансированный рост путем подавления синтеза ДНК (фтордезоксиуридин или цитозинарабинозид), или' агенты, включающиеся в ДНК и оказывающие повреждающее действие (высокие концентрации тритированного тимидина или бромдезоксиуридин, который при последующем облучении в ДНК индуцирует разрывы (Thompson et al., 1970). Как правило, выделенные мутанты оказываются температурочувствительными по синтезу ДНК (Sheinin, 1976; Nishimoto et al., 1978), но Базили-Ко (Basilico, 1978) предложил следующие процедуры для отбора ts-мутантов по фазам G1 и G2. 1. Отбор мутантов по фазам G1 и S. а. Мутагенизировать клетки, как указано в разд. 13.1.

б. Синхронизировать клетки в фазе G1 голоданием по изолей-цину (разд. 11.7).

■в. Снять блок при 39 °С (разд. 11.7) в присутствии 5 мкм 5-фтордезоксиуридина в течение двух суток, или

г. Снять блок при 33 °С в присутствии 2 мМ гидроксимочевины и спустя 10 ч инкубировать при 39 °С в течение 12—16 ч в среде без гидроксимочевины, но с 5-фтордезоксиуридином. Этап в приводит к выходу мутантов по фазе G1, поскольку

у мутантов по другим фазам начинается несбалансированный

рост, и они гибнут. По тем же причинам этап г дает мутантов

по фазе S.

2. Отбор мутантов по фазам G2 и М.

а. Мутагенизировать клетки, как указано в разд. 13.1.

5. Повысить температуру инкубации до 39 °С и инкубировать

в течение времени генерации, что приводит к блокированию

всех ts-мутантов.

в. Отделить митотические клетки (разд. 11.2), которые включают в себя мутантов, блокированных в митозе.

г. Инкубировать при 39 °С в течение времени генерации в присутствии фтордезоксиуридина, индуцирующего несбалансированный рост клеток дикого типа, приводящий к их гибели (разд. 11.8).

д. Снизить температуру до 33 °С и отобрать митотические клетки (разд. 11.2) в течение следующих I—2 ч; эти клетки будут мутантами по фазе G2.

Во всех случаях клетки должны быть клонированы <разд. 8.1) и тестированы на эффективность процесса отбора.

13А. Посев реплик животных клеток

Один из приемов, позволяющих бактериологу отбирать тысячи мутантов, основан на возможности переносить большое число клонов с одной чашки на другую, сохраняя их взаимное расположение. Используя этот прием, можно тестировать одновременно тысячи или более клонов по нескольким характеристикам роста и отбирать с исходных чашек интересующие клоны.

При работе с животными клетками возникают проблемы),

связанные с тем, что клетки растут прочно прикрепленными к субстрату и в то же время двигаются по нему, так что выбранный клон быстро разрастается, занимая значительную поверхность. Недавно был предложен метод, позволяющий обойти эти проблемы (Esko, Raetz, 1978).

— Клеточные монослои обработать мутагенным агентом этил-метансульфонатом (40 мкг/мл; Eastman Ltd.) и дать им расти в течение трех суток. — Около 1000 клеток высеять в чашки Петри диаметром 10 см,

содержащие по 15 мл ростовой среды, и инкубировать в течение суток.

— Поместить диски стерильной бумаги ватман № 50 на поверхности жидкости и утопить их с помощью стеклянных бус так,, чтобы они образовали одинарный ровный слой.

— Менять среду каждые 2—3 дня.

— После 7—8 дней отсосать среду, убрать бусы и удалить бумажные диски, к которым прикреплены более 95% клеток..

— Промыть бумажные диски струей среды (30 мл) для удаления маленьких комков клеток.

— Поместить диски с клетками (клетками вниз) на поверхности культуральной среды в свежих чашках, утопить их и инкубировать.

—- Повторять последние 3 раза стадии каждые 3 дня, получая каждый раз чашки, являющиеся репликами исходной. Клетки на бумажных дисках сохраняют жизнеспособность и могут быть использованы для радиоавтографического анализа. С другой стороны, они могут быть лизированы замораживанием и оттаиванием и инкубированы в ферментативном тесте.

Другим методом, приводящим к тому же результату, является посев мутагенизированных клеток в пластинку для микротитрования с 96 лунками, как для клонирования клеток. Когда колонии вырастут, клетки можно собрать и распределить между несколькими микротитровальными пластинками, используя ручные или автоматические сборщики клеток и разбавители, поставляемые Titertek (Flow Labs. Ltd.).

13.5. Гибридизация соматических клеток

Этот метод лежит в основе генетического анализа культивируемых клеток животных, и результаты исследований, публикуемых в журнале «Somatic Cell Genetics», получены, как правило, именно этим методом. В 1976 г. была опубликована монография, посвященная клеточным гибридам (Ringertz, Savage, .1976). Этот анализ является более грубым, чем генетический анализ у бактерий, но в настоящее время позволяет без труда локализовать отдельные гены в хромосомах. Традиционно такие исследования проводятся путем анализа потомков родителей,, обладающих теми или иными фенотипическими характеристиками, но этот анализ был переведен на уровень биохимических признаков, после того как было показано, что в определенных условиях две клетки могут сливаться in vitro, образуя гетерока-рион, т. е. одну клетку, содержащую два различных ядра. Небольшая часть таких клеток способна неограниченно размножаться. Первое митотическое деление после слияния приводит к появлению дочерних клеток с обоими наборами хромосом в одном ядре. Очень часто в ходе последующих делений вследствие

аномалий митоза происходит потеря хромосом поодиночке или попарно, пока не установится новая стабильная линия клеток, несущих те или иные хромосомы от каждого родителя (Weiss, Green, 1967; Ruddle, 1973; Glies, Ruddle, 1973). В гибридах клеток человека и мыши или китайского хомячка и мыши всегда сохраняются именно мышиные хромосомы (Matsuya, Green, 1969).

При работе с клеточными гибридами возникает необходимость, с одной стороны, уметь отбирать гибриды, и с другой — их идентифицировать. Наиболее простой комплементационный анализ включает в себя слияние клеток, различающихся по единичным мутациям. Так, если клетки, нуждающиеся для роста в глицине (gly~), слить с клетками, нуждающимися для роста в гипоксантине (hyp-), то, если мутации рецессивные, гетерока-рионы смогут расти в среде, лишенной одновременно и глицина и гипоксантина. Это можно использовать для отбора продуктов слияния.

Аналогично, если мышиные клетки, лишенные тимидинкиназы и не растущие, следовательно, в присутствии аминоптерина и тимидина, слить с клетками человека, лишенными гипоксан-тин-фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ) и не растущими в присутствии аминоптерина и гипоксантина, то только продукты слияния смогут расти в НАТ-среде, содержащей гипоксантин (10~⁴М), аминоптерин (4-10~⁷М) и тимидин (10~⁵М) (Little-field, Goldstein, 1970). Как указывалось выше, такие гетерока-рионы преимущественно утрачивают хромосомы человека. Одна человеческая хромосома, которую гетерокарионы не могут утратить без потери способности к росту в среде HAT, представляет собой хромосому, несущую ген тимидинкиназы. Отбирая различные клоны, получаемые при этом слиянии, и проводя анализ набора хромосом человека в клетках клонов, можно установить, какая хромосома является незаменимой, и, следовательно, локализовать хромосомное расположение гена тимидинкиназы (Weiss, Green, 1967).

С помощью этого метода было показано, что ген для ГФРТ локализован в Х-хромосоме. Этот результат лег в основу многих последующих исследований. Сейчас предпринимаются попытки сливать клетки, у одной из которых хромосомы фрагмен-тированы облучением. Частота совместного с ГФРТ переноса того или иного признака в стабильные клоны служит мерой расстояния между генами соответствующих маркеров, и с помощью этого метода получено относительно тонкое генетическое картирование животных клеток (Goss, Harris, 1975).

Сходный метод включает в себя выделение и фракционирование хромосом донорных клеток, сопровождающиеся введением хромосом в фрагментированной форме в мутантные клетки-реципиенты (Willecke et al., 1976а, b). И в этом случае степень

совместного переноса отдельных генов служит мерой расстояния между ними.

Другие системы отбора основаны на слиянии нормальных лимфоцитов человека или клеток асцитных опухолей (плохо растущих in vitro) с дефектными мышиными клетками (опять в среде HAT) или слиянии нуждающихся в пролине клеток СНО и дефектных мышиных клеток в лишенной пролина среде HAT.

Клетки человека гибнут в присутствии 10^-7М уабаина, а клетки мыши относительно устойчивы к этому агенту, и летальная доза уабаина для мышиных клеток составляет 10^_3М. Гибридные клетки мыши и человека обладают промежуточной чувствительностью, в связи с чем среда HAT, содержащая 10~⁷М уабаина, может быть использована в качестве селективной для отбора гибридных клеток человека и мышиных клеток ТК~ или ГФРТ^-. Это позволяет использовать в опытах по слиянию первичные культуры клеток человека и другие неселектируемые штаммы (Mayhew, 1972; Thompson, Baker, 1973).

13.5.1. Слияние клеток с помощью вируса Сендай

Клетки способны к спонтанному слиянию, но частота слияний резко увеличивается при обработке клеток различными агентами, наиболее распространенным из которых является инактиви-рованный вирус Сендай.

Используются вирусы; инактивированные ультрафиолетовым облучением или обработкой (3-пропиолактоном (Neff, Enders,. 1968) (см. разд. 14.2.4).

Слияние клеток лучше проводить в суспензии, но можно использовать и клеточные монослои. Действие вируса Сендай трудно контролировать, и процесс слияния клеток в монослое,, выйдя из-под контроля, может приводить к образованию поли-кариот, содержащих до 10 ядер, большинство из которых оказываются нежизнеспособными. Для ограничения этого процесса рекомендуется брать сливаемые клетки в неравных количествах, например 1:1000. Монослой смешанных клеток следует проинкубировать в течение 24 ч, и затем, после удаления среды, обработать клетки инактивированным вирусом Сендай при О—4°С в течение 10 мин (за это время происходит адсорбция вируса), промыть несколько раз средой, не содержащей сыворотки, и инкубировать далее в ростовой среде при 37 °С. В этих условиях сливается примерно 4% клеток, но точное число слившихся клеток зависит главным образом от типа использованных клеток. При инкубации обработанных вирусом клеток при 37 °С клеточная мембрана, прилежащая к участкам адсорбции вируса, повреждается и образуются цитоплазматические мостики, соединяющие соседние клетки. Этот процесс происходит в тече-

ние 1 мин. По мере репарации поврежденных участков межклеточные мостики уширяются и образуется гигантская клетка (Hosaka, Koshi, 1968). После инкубации при 37 °С в течение часа клетки следует собрать и высеять в новый культуральный сосуд при плотности 10⁵ клеток в 1 мл.

Предлагается следующая стандартная процедура для слияния клеток инактивированным вирусом Сендай:

— Суспензии двух типов клеток, предназначенных к слиянию, смешать в сосуде с завинчивающейся крышкой. (5—10) «10^е клеток каждого типа должно присутствовать в общем объеме 1 мл СБСР.

— Равный объем (1 мл) инактивированного вируса Сендай (4-Ю¹⁰ частиц или 1000 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ)/мл) (разд. 14.3.3) добавить к клеточной суспензии и довести рН до 8,0—8,5.

— Легко встряхивать сосуд при 37 °С в течение 30—40 мин. Некоторые авторы рекомендуют предварительно встряхивать суспензию при 0—4°С в течение 30 мин. Встряхивание суспензии при 37 °С приводит к немедленному слипанию клеток и некоторому снижению рН.

— Перенести 1 мл суспензии в чашку Петри диаметром 5 см и добавить 4 мл полной среды (Watkins, 1971; Stadler, Adel-berg, 1972).

13.5.2. Слияние клеток ВИК21/С13 с эритроцитами кур с использованием вируса Сендай

Эритроциты птиц имеют ядра, но вирус Сендай, помимо того, что он индуцирует агглютинацию, вызывает также гемолиз, так что в слиянии участвуют тени эритроцитов, имеющие ядра и при этом содержащие мало цитоплазмы.

— Трипсинизировать (разд. 5.2) клетки хомячка и ресуспендировать их в среде Игла с 10% сыворотки теленка. Промыть дважды центрифугированием и ресуспендировать в свежей МСИ без сыворотки (приложение 1) до концентрации 2- 10^е клеток в 1 мл.

— Выделить эритроциты из 17-дневного оплодотворенного куриного яйца. Для этого удалить скорлупу над воздушным мешком, разрезать кровеносные сосуды в оболочке и дать крови излиться в аллантоисную жидкость. Удалить жидкость и промыть клетки МСИ без сыворотки (0,5 мл).

— Смешать 0,1 мл суспензии клеток хомячка с 0,1 мл суспензии эритроцитов и 0,1 мл инактивированного вируса Сендай (200 ГАЕ) в 15-миллилитровой -стерильной центрифужной пробирке и инкубировать при 37 °С в течение 25 мин.

— Прилить в пробирку МСИ с 10% сыворотки теленка до об-

щего объема 5 мл и перенести суспензию в чашку Петри диаметром 5 см, содержащую покровные стекла. Инкубировать при 37 °С в продуваемом ССЬ термостате. Удалить покровные стекла, промыть их дважды в ФСБ-А (приложение 1) и фиксировать в метаноле (10 мин). Окрашивать 3 мин по Мэй-Грюнвальд Гимза (приложение 2), промыть дистиллированной водой и ацетоном и заключить на предметном стекле клетками внутрь.

13.5.3. Слияние клеток с помощью лизолецитина

Трудности, связанные с использованием инактивированного вируса Сендай, привели к развитию других методов слияния клеток. Наиболее простые из этих методов — это методы слияния с помощью лизолецитина и с помощью полиэтиленгликоля.

— Совместно культивировать в течение ночи около 2-10⁵ клеток каждого типа в 4 мл среды.

— Удалить среду и дважды промыть пласт клеток 4 мл ацетатного буфера (0,1 М NaCl; 0,05М ацетата натрия, рН 5,8).

--Добавить 4 мл ацетатного буфера, содержащего лизолеци-

тин (100 мкг/мл).

— Через 15 мин при 37 °С удалить лизолецитин, дважды промыть клеточный пласт полной средой и вернуть клетки в термостат в 4 мл полной среды (Croce et al., 1971; Keay et al., 1972).

13.5.4. Слияние клеток с использованием полиэтиленгликоля

Этот метод, предложенный Понтекорво (Davidson et al., 1976; Pontecorvo et al., 1977), является самым простым и наиболее часто используется.

— Приготовить смешанную суспензию клеток, предназначенных для слияния, и осадить клетки. Этот этап представляет собой наиболее важную часть всей процедуры, но эффективность слияния увеличивается при последующих обработках.

— Ресуспендировать клеточный осадок в 0,5 мл 40—50%-ного полиэтиленгликоля (PEG 1500) в среде, не содержащей сыворотки. Присутствие 15% диметилсульфоксида может увеличить выход гибридных клеток.

— После инкубации при 37 °С в течение 1 мин добавить еще 0,5 мл 20%-ного полиэтиленгликоля в среде без сыворотки.

— После 3-минутной инкубации разбавить суспензию полной средой, промыть клетки переосаждением и высеять их в многолуночную пластинку в селективной среде.

13.6. Межклеточные связи

Ни клетки ТК" ни клетки ГФРТ- не способны расти в отдельности в среде HAT, но смешанная популяция этих двух мутантных линий может расти в среде HAT (рис. 13.5).

Эта метаболическая кооперация — отнюдь не результат отбора гибридных клеток, поскольку она обнаруживается сразу после смешивания клеток в отсутствие индуцирующих слияние

Время, ч

Рис. 13.5. Метаболическая кооперация клеток ВНК21/13. Рост клеток ВНК-ГФРТ- и ВНК-ТК" отдельно и в смешанной (1:1) культуре в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT). ГФРТ — гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза; ТК — тимидинкиназа. [Перепечатано из (Pitts, 1971) с любезного разрешения автора и издателей.]

агентов. Кооперация обусловлена обменом низкомолекулярных соединений через соединяющие клетки щелевые контакты (gap junctions). Благодаря этим контактам клетки ТК" получают тимидилат от соседних клеток ГФРТ^-, а последние получают в обмен пуриновые нуклеотиды. Другими низкомолекулярными соединениями, проходящими через щелевые контакты, являются тетрагидрофолят (Finbow, Pitts, 1979) и красители различного размера с мол. массой вплоть до 1000 (Pitts, Finbow, 1977; Bennet, 1973); следовательно, соседние клетки могут обмениваться большинством мелких молекул.

Для возникновения межклеточных связей необходимо наличие между клетками контакта. Используя радиоавтографический метод, можно показать, что диффузия нуклеотидов между клетками возможна только при наличии щелевого контакта, а клетки, расположенные на таком же расстоянии, но не имеющие истинного контакта, оказываются несвязанными.

Возникновение межклеточных связей может затруднять отбор гибридов, если только клетки не посеяны с низкой плотностью, что делает образование контактов маловероятным. С другой стороны, гибриды могут быть получены с помощью клеток, которые не способны к образованию связей. Одной из линий клеток, утративших способность к образованию межклеточных связей, является линия клеток L929 и полученная из нее сублиния А9 ГФРТ- (Pitts, 1971).

13.6.1. Подсчет числа зерен и межклеточные связи

Инкубация клеток с тритированными уридином или гипоксан-тином приводит к включению радиоактивности в РНК во всех клетках, за исключением митотических. Подсчет числа зерен на радиоавтографах показывает, что оно соответствует распределению Пуассона со средней точкой, отвечающей относительной скорости синтеза РНК в культуре. При инкубации клеток ГФРТ- с тритированным гипоксантином над клетками обнаруживается только фоновое количество зерен серебра. Смешанные популяции клеток, часть из которых лишена ГФРТ, легко различаются при посеве с низкой плотностью. Однако при высокой плотности клеток, когда возможны межклеточные коммуникации и ГФРТ-положительные клетки могут передавать радиоактивные нуклеотиды своим мутантным соседям через щелевые контакты, различить клетки оказывается значительно сложнее (Pitts, Simms, 1977). Дифференциация клеток в этих условиях может быть проведена только с помощью компьютерной программы, которая не только выявляет наличие двух типов клеток, но и позволяет вычислить среднее число зерен над клетками каждого типа.