Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

Приложение 1. Составы сред

 

ТАБЛИЦА 1

Сбалансированные буферные солевые растворы (СБСР) Эрла и Хэнкса, концентрированные в 10 раз, без бикарбоната и глюкозы

1) В некоторых случаях в СБСР Хэнкса половина MgSO4*7H2O замещается на MgCl2-6H₂0.

2) Этот компонент лучше растворить отдельно и добавить в последнюю очередь при помешивании.

Добавить к СБСР 10 мл хлороформа и хранить при 4°С в полиэтиленовых сосудах.

ЛКМС (лишенная кальция и магния среда) представляет собой СБСР Эрла, не содержащий кальция и магния.

СБСР может быть использован в качестве солевого раствора, в частности, для промывания фрагментов ткани. В этом случае 50 мл 10-кратного концентрата смешивают с 450 мл дистиллированной воды. Если же СБСР используется в качестве основы для составления культуральной среды (когда дополнительные ингредиенты добавляют позднее), то 50 мл 10-кратного концентрата следует смешивать с 350 или 400 мл дистиллированной воды. Раствор в бутылях объемом 500 мл следует автоклавировать при 1 атм в течение 20 мин. Стерилизованный СБСР можно хранить при комнатной температуре.

Перед употреблением довести рН до 7,4, добавив бикарбонат (20 мл 5,6%-ного раствора в СБСР Эрла и З мл_5,6%-ного раствора в СБСР Хэнкса) или буфер Hepes (5 мл 1,0 М). Добавить глюкозу и другие требуемые ингредиенты.

ТАБЛИЦА 2

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Дюльбекко

Раствор ФСБ-А	1 л	10 л
NaCl	10 Г	100 г
КС1	0,25 г	2,5 г
Na2HP04	1,44 г	14,4 г
KH2P04	0,25 г	2,5 г
рН 7,2

Буфер разлить в бутыли объемом 160 или 400 мл.

Для стерилизации автоклавировать при давлении Г атм в течение 20 мин. Хранить при комнатной температуре.

Раствор ФСБ-Б	1 л
СаС12-2Н20	1,0 г
Буфер разлить в бутыли объемом 20 или 50 мл. Для стерилизации автоклавировать при давлении 1 атм в течение 15 мин. Хранить при комнатной температуре.
Раствор ФСБ-В	1 л
MgС12-6Н20	1,0 г

Буфер разлить в бутыли объемом 20 или 50 мл.

Для стерилизации автоклавировать при давлении 1 атм в течение 15 мин. Хранить при комнатной температуре.

Для получения полного ФСБ смешать 20 мл ФСБ-В и ФСБ-С с 160 мл ФСБ-А, либо 50 мл ФСБ-Б, и ФСБ-В смешать с 400 мл ФСБ-А.

ТАБЛИЦА 3 Бикарбонат натрия (5,6%).

— Растворить 56 г NaHCO₃ в дистиллированной воде. Добавить 1,5 мл 1%-но-го раствора фенолового красного и довести объем до 1 л.

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

— Разлить в бутыли объемом 20, 100 и 200 мл.

- Тщательно закупорить бутыли, используя по возможности резиновые пробки с металлической окантовкой.

— Проверить аликвоты растворов на бактериальное заражение, используя

а) жидкую среду Саборада при 31 °С в течение 1 недели (приложение 4),

б) бульон с экстрактом сердца и мозга при 37 °С в течение 1 недели (приложение 4).

— Хранить при комнатной температуре.

ТАБЛИЦА 4

Глюкоза (10%; вес/объем)

— Растворить 100 г глюкозы в дистиллированной воде.

— Довести объем раствора до 1 л.

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

— Разлить в бутыли объемом 5 и 10 мл и хранить при — 20 °С.

ТАБЛИЦА 5 Буфер Hepes

— Растворить 47,6 г буфера Hepes в 200 мл дистиллированной воды и довести рН до 8,1 с помощью NaOH.

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм и хранить алнквотами по 5 мл при комнатной температуре.

— Проверить на бактериальное заражение, используя

а) жидкую среду Саборада при 31 °С в течение 1 недели (приложение 4),

б) бульон с экстрактом сердца и мозга при 37 °С в течение 1 недели (приложение 4).

ТАБЛИЦА 6

Раствор антибиотиков (100-кратный концентрат).

Натрийбензилпенициллин G (Кристопен) 10 000 000 ед.

Стрептомицинсульфат 10 г

Дистиллированная вода до 1 л

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

— Разлить в бутыли объемом 5, 20 и 50 мл.

— Проверить на бактериальное заражение, используя

а) жидкую среду Саборада при 31 °С в течение 1 недели (приложение 4), б) бульон с экстрактом сердца и мозга при 37 °С в течение 1 недели (приложение 4).

— Хранить при —20 °С.

Пенициллин я стрептомицин могут быть получены от Glaxo Labs. (см. приложение 3).

ТАБЛИЦА 7

Феноловый красный 1% (для использования в качестве индикатора в СБСР и культуральных средах).

— Растворить 10 мл фенолового красного в 245 мл дистиллированной воды с 5 мл 5 н. NaOH.

— Добавлять по каплям 1 н. HCI, пока раствор не приобретает глубокий кроваво-красный цвет.

— Довести объем до 1 л дистиллированной водой.

— Профильтровать через фильтровальную бумагу ватман № 1.

— Разлить в бутыли и хранить при 4 °С.

ТАБЛИЦА 8

Заменимые аминокислоты Игла (100-кратный концентрат).

г/л

L- Алании 0,89

L-Аспарагин-Н₂0  1,50

L-Аспарагиновая кислота 1,33

L-Глутаминовая кислота 1,47

Глицин 0,75

L-Пролин 1,15

L-Серин 1,05

ТАБЛИЦА 9

Гидролизат лактальбумина поставляется Nutritional Biochemicals (США) в виде сухого порошка; хранится в темных закупоренных сосудах. Гидролизаг растворяют до 5%-ной концентрации в СБСР Хэикса и автоклавируют при 115°С в течение 10 мин, после чего его можно хранить при комнатной температуре в течение месяца или более. При хранении в замороженном состоянии образуется осадок, растворяющийся при нагревании в кипящей водяной бане-Перед использованием концентрат разводят культуральной средой в 10 раз до концентрации 0,5%.

ТАБЛИЦА 10 Экстракт куриного эмбриона

— Извлечь асептически из яиц 10-дневных эмбрионов (как описано в разд. 6.8) и промыть их в СБСР Хэикса. Гомогенизировать в блендоре в течение 60 с при максимальной скорости в равном объеме СБСР Хэнкса.

— Инкубировать в течение 1 ч при 4°С и центрифугировать при 35 000 g 20 мин.

Заморозить надосадочную фракцию при -20 °С в течение ночи. Затем разморозить, повторно центрифугировать и аликвоты повторно заморозить для хранения.

ТАБЛИЦА 11 Триптозофосфатный бульон

Триптозофосфатиый бульон (Oxoid 147,5 г

или Difco bacto; приложение 3)

Дистиллированная вода до 5 л

— Разлить по 50 мл в 4-унциевые¹ плоские медицинские флаконы.

— Стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм в течение 15 мин.

— Инкубировать при 37 °С в течение 7 дней.

— Проверить каждую бутыль на мутность перед хранением при комнатной температуре.

ТАБЛИЦА 12

Состав сред Игла (аминокислоты и витамины)

	БСИ	МСИ	МСИ Глазго	мси Дюльбекко
Аминокислоты (мг/л)
L-аргинин-НС1		126,0	42,0	84,0
L-аргинин	17,4
L-цистин	12,0	24,0	24.0	48,0
L-глутамин	292,0	292,0	292,0	584,0
L-глнцин				30,0
L-гистидин-НСl • Н2О		42,0	21,0	42,0
L-гистидин	8,0
L-изолейцин	26,0	52,0	52,4	105,0
L-лейцин	26,0	52,0	52,4	105,0
1-лизин-НС1		72,5	73,1	146
L-лизин	29,2
L-метионин	7,5	15,0	15,0	30,0
L-фенилаланин	16,5	32,0	33,0	66,0
L-серин				42,0
L-треонин	24,0	48,0	47,6	95,0
L-триптофан	4,0	10,0	8,0	16,0
L-тирозин	18,0	36,0	36,2	72,0
L-валин	23,5	46,0	46,8	94,0
витамины (мг/л)
Биотин	1,0
D-Ca-пантотенат	1,0	1,0	1,0	4,0
Холинхлорид	1,0	1,0	1,0	4,0
Фолиевая кислота	1,0	1,0	1,0	4,0
i-инозитол	2,0	2,0	2,0	7,2
Никотинамид	1,0	1,0	1,0	4,0
Пиридоксаль-НС1	1,0	1,0	1,0	4,0
Рибофлавин	0,1	0,1	0,1	0,4
Тиамин-НС1	1,0	1,0	1,0	4,0

Аминокислоты и витамины растворяют в СБСР Эрла или Хэнкса. МСИ в модификации Дюльбекко готовят на СБСР Эрла, содержащем избыточные количества бикарбоната (3,7 г/л) и глюкозы (4,5 г/л), а также нитрат железа (0,1 мг Fe(N0₃) -9Н₂0 в 1 л).

Составы сред соответствуют первоначально предложенным Иглом (Eagle, 1955а, 1959).

ТАБЛИЦА 13 10-кратный концентрат МСИ

Коммерческие поставки (например, от Flow Laboratories или Gibco-Biocult; см. приложение 3) включают в себя 50-кратные концентраты аминокислот и 100-кратные концентраты витаминов МСИ. Концентраты аминокислот можно хранить при комнатной температуре, но концентраты витаминов должны быть з.аморожены вплоть до непосредственного использования.

Аминокислоты и витамины можно смешивать в асептических условиях, но поскольку к конечному раствору следует добавлять глюкозу и глутамин, нуждающиеся в стерилизации фильтрованием, то удобнее стерилизовать готовый 10-кратный концентрат:

Аминокислоты МСИ 200 мл (50-кратный концентрат)

Витамины МСИ 100 мл (100-кратный концентрат)

L-глутамин2 2,925 г

Глюкоза 45 г

Перегнанная в стекле до 1 л дистиллированная вода

— Довести рН до 7,1, используя 5 и. NaOH (примерно 10 мл).

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

— Разлить в бутыли объемом 50, 100, 200 и 400 мл.

— Проверить на бактериальное заражение, используя

а) жидкую среду Саборада при 31 °С в течение 1 недели (приложение 4),

б) бульон с экстрактом мозга и сердца при 37 °С в течение 1 недели (приложение 4).

— Хранить при 4 °С до получения результатов проверки.

ТАБЛИЦА 14

10-кратный концентрат МСИ в модификации Дюльбекко

Концентрат готовится так же, как и 10-кратный концентрат МСИ, но с ис-

 

пользованием 25-кратного концентрата аминокислот Дюльбекко.

	для приготовления 1 л
25-кратный концентрат аминокислот Дюльбекко	400 мл
100-кратный концентрат витаминов МСИ	400 мл
Глюкоза	45 г
Дистиллированная вода	200 мл
Довести рН до 7,1, используя 5 н. NaOH

— Стерилизовать фильтрованием, используя мембранный фильтр с диаметром

пор 0,22 мкм.

— Разлить в бутыли объемом 50 и 100 мл.

— Проверить на бактериальное заражение, как указывалось выше. Примечание. L-глутамин добавляется к разведенной среде непосредственно перед использованием (10 мл 200 мМ глутамина на 500 мл среды).

ТАБЛИЦА 15

Приготовление среды Игла из концентратов

Приведенные ниже прописи основаны на использовании 10-кратного концентрата МСИ без солей (см. табл. 13) илн 10-кратного концентрата МСИ в модификации Дюльбекко (см. табл. 14). В том случае, когда 10-кратный концентрат содержит соли (например, при приготовлении из сухой среды), то «го следует разводить не СБСР, а перегнанной в стеклянной посуде стерильной дистиллированной водой.

а) Минимальная среда Игла с 10% сыворотки теленка (МСИ10). Используется в качестве ростовой среды для наиболее распространенных клеточных линий, таких, как L929, HeLa, СНО, ВНК21/С13, и некоторых линий клеток, трансформированных вирусом полиомы. При добавлении в среду пролина поддерживает рост линий клеток СНО pro^-.

-СБСР 450 мл

МСИ 10-кратный концент- 50 мл рат

NaHC03 (5,6%; табл. 3) 20 мл

Сыворотка теленка 50 мл

Антибиотики (100-кратный 5 мл концентрат; табл. б)

б) Модификация Глазго МСИ с 10% сыворотки теленка и 10% триптозофос-фатного бульона. Обеспечивает улучшенный рост культуры клеток ВНК21/С13 и некоторых трансформированных вирусом полиомы линий.

СБСР  400 мл

МСИ Глазго, 10-кратный 50 мл концентрат

NaHC0₃ (5,6%; табл. 3) 20 мл

Сыворотка теленка 50 мл

Триптозофосфат (табл. 11) 50 мл

Антибиотики (100-кратный 5 мл концентрат; табл. 6)

в) Минимальная среда Игла с 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и заменимыми аминокислотами. Рекомендуется для выращивания клеток BSC1, CV1 и РТ-К; кроме того, обеспечивает лучший рост клеток L929 и HeLa.

СБСР¹) 450 мл

МСИ, 10-кратный концент- 50 мл

рат

NаНСОз (5,6%; табл. 3) 20 мл

Сыворотка эмбриона круп- 50 мл

ного рогатого скота

Заменимые аминокислоты 5 мл

Игла (100-кратный концентрат; табл. 8)

Антибиотики (100-кратный 5 мл

концентрат; табл. 6)

г) В МСИ Дюльбекко могут быть добавлены 10% сыворотки теленка, 20% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота или их смесь.

СБСР¹) 400 мл

МСИ Дюльбекко, 10-кратный концентрат 50 мл

NaHCO3 (5,6%; табл. 3) 30 мл

Сыворотка эмбриона крупного рогатого скота 100 мл

Антибиотики (100-кратный

концентрат; табл. 6) 5 мл

Глутамин 200 мМ 10 мл

Примечание. Все ингредиенты следует асептически добавлять в бутыли с СБСР, а среду перед использованием необходимо прогревать при 37 °С. Среду можно хранить при 4 °С в течение 2—3 недель.

В отсутствие антибиотиков (как чаще всего рекомендуется) образцы ростовой среды следует инкубировать при 37 °С в течение 3 суток и при комнатной температуре в течение последних 2 суток. Бутыли, в которых обнаруживается загрязнение микроорганизмами, следует отбрасывать.

1) СБСР во всех случаях готовят из 50 мл 10-кратного концентрата СБСР, разведенного до соответствующего объема дистиллированной водой и стерилизованного автоклавированием (табл. 1).

ТАБЛИЦА 16

Среда Хэма F12 Согласно прописи Хэма

(Ham, 1965).

	мг/л		мг/л
Аминокислоты		Липоевая кислота	0,206
L-аланин	3,91	Ниацинамид	0,037
L-аргинин-НО	210,7	Пиридоксин-НС1	0,062
L-аспарагин	15,01	Рибофлавин	0,038
L-аспарагиновая кис-		Тиамин-НС1	0,337
лота	13,31	Витамин В12	1,357
L-цистеин-НС1 • Н20	35,12	Соли
L-глутаминовая кислота	.14,71	КО	223,65
L-глутамин	146,2	NaCl	7,6
Глицин	7,51	Na2HP04-7H20	268,1
L-изолейцин	3,94	FeS04-7H20	0,834
L-лейцин	13,12	MgCl2-6H20	122,0
L-лизин-НС!	36,54	СаС12-2Н20	44,11
L-метнонин	4,48	CuS04-5H20	0,0025
L-фенилаланин	4,96	ZnS04-7H20	0,863
L-пролин	34,53	NaHC03	1,176
L-серин	10,51	Другие компоненты
L-треонин	11,91	Феноловый красный	1,242
L-триптофан	2,04	Глюкоза	1801,6
L-тирозин	5,44	Na-пируват	110,1
L-валин	11,71	Путресцин-2НС1	0,161
Витамины		Гипоксантин	4,083
Биотин	0,007	ЛтЫО-ИНОЗИТОЛ	18,02
Са-пантотенат	0,258	Тимидин	0,727
Холинхлорид	13,96	Линолевая кислота	0,084
Фолиевая кислота	1,324

ТАБЛИЦА 17

Среда Мак-Коя 5а (RPMI 1629)

Исходная пропись Мак-Коя и др. (McCoy et al., 1959) с более поздними модификациями (Hsu, Kellogg, 1960; Iwakata, Grace, 1964)

мг/л

Аминокислоты

L-аланин 13,90

L-аргинин-НСl 42,10

L-аспарагин 45,00

L-аспарагиновая кисло- 19,97 та

L-цистеин

L-глутаминовая кислота

L-глутамин Глицин

L-гистидин-НС! • Н_аО

мг/л

31,50 22,10

л-Аминобензойная кислота

Пиридоксаль-НС1

Пиридоксин-НС1

Рибофлавин

Тиамин-НС1

Витамин В12

Соли

СаС1₂

КС1

MgS0₄-7H₂0 NaCl NaHC0₃ NaH₂P0₄H₂0 Другие компоненты Феноловый красный Глюкоза Глутатион Бакто-пептон

Сыворотка крупного скота

эмбриона рогатого

Продолжение мг/л 1,00

0,50 0,50 0,20 0,20 2,00

100,0 400,0 200,0 6460,0 2200,0 580,0

10,0 3000,0 0,50 600,0 0—30%

ТАБЛИЦА 18 Среда 199

В прописи Моргана и др.

Аминокислоты

L-аланин

Ь-аргинин-НС1

D.L-аспарагиновая кислота

Ь-цистеин-НС1

L-цистин

L-глутаминовая кисло-та-НгО

L-глутамин •

Глнцин

Ь-гистидин-НС1 L-гидроксипролин

(Morgan et al., 1950, 1955). мг/л

50,0 70,0 60,0

0,1 20,0 150,0

100,0 50,0 20,0 10,0

D,L-изолейцин D.L-лейцин L-лизин-НС! D.L-метионин D.L-фенилаланин L-пролин D,L-cepHH D.L-треонин И^-триптофан L-тирозин D.L-валин Витамины

мг/л 40,0 120,0 70,0 30,0 50,0 40,0 50,0 60,0 20,0 40,0 50,0

L-гидроксипролин 19,70

L-изолейцин 39,36

L-лейцин 39,36

Ь-лизин-НС1 36,50

L-метионин 14,90

L-фенилаланин 16,50

L-пролин 17,30

L-сернн 26,30

L-треонин 17,90

L-триптофан 3,10

L-тирозин 18,10

L-валин 17,60 Витамины

Аскорбиновая кислота 0,50

Биотин 0,20

Холинхлорид 5,00

D-Ca-пантотенат 0,20

Фолиевая кислота 10,00

/-инозит 36,00

Никотинамид 0,50

Никотиновая кислота 0,50

	мг/л		мг/л
Аскорбиновая кислота	0,050	Ниацин	0,025
d-биотин	'0,010	Ниацинамид	0,025
Кальциферол	0,100	л-Аминобензойная кис-	0,050
Са-пантотенат	0,010	лота
Холинхлорид	0,500	Пиридоксаль-НС1	0,025
Фолиевая кислота	0,010	Пиридокснн-НС1	0,025
1-ИНОЗИТОЛ	0,050	Рибофлавин	0,010
Менадион	0,010	Тиамин-НС1	0,010
		Витамин А (ацетат)	0,14

Неорганические соли СБСР Хэнкса СБСР Эрла

мг/л мг/л

СаСЬ (безводный) 140,0 200,0 Нитрат железа

Fe(N0₃)₃ 0,1 0,1

КС1 400,0 400,0

КН₂Р0₄ -60,0 —

MgS0₄-7H20 200,0 200,0

NaCl 8000,0 6800,0

NaHC0₃ 350,0 2200,0

NaH₂P0₄H₂0 — 140,0

Na₂HP0₄-2H₂0 60,0 —

Другие компоненты мг/л

Аденинсульфат 10,0

Аденозинтрифосфат 1,0 (двунатриевая соль)

Адениловая кислота 0,20

а-Токоферолфосфат 0,01 (натриевая соль)

Холестерин 0,20

Дезоксирибоза 0,50

Глюкоза 1000,0

Глутатион 0,05

Другие компоненты мг/л

Гуанин-НС1 0,30

Гипоксантин . 0,30

Феноловый красный 20,0

Рибоза 0,50

Ацетат натрия 50,0

Тимин 0,30

Твин 80с 20,00

Урацнл 0,30

Ксантин 0,30

ТАБЛИЦА 19 Среда NCTC 135

В прописи Эванса и др. (Evans et al., 1964).

мг/л

Аминокислоты

L-аланин	31,48
L-a-амино-к-масляная	5,51
кислота
Ь-аргинин-НС1	31,16
L-аспарагин-НгО	9,19
L-аспарагиновая кис-	9,91
лота
L-цистин, двунатриевая	12,41
соль
L-глутаминовая кисло-	8,26
та
L-глутамин	135,7
Глутатион	10,00
Глицин	13,51
Ь-гистидин-НС1 • Н20	26,65
L-гидроксипролин	4,09
L-изолейцин	18,04
L-лейцин	20,44
L-лизинтНС!	38,43
L-метионин	4,44
L-ophhthh-HC1	9,41
L-фенилаланин	16,53
L-пролин	6,13
L-серин	10,75
Таурин	4,18
L-треонин	18,93
L-триптофан	17,5
L-тирозин	16,44
L-валин	25,00

Витамины

L-аскорбиновая та

кисло- 50,00

Биотнн 0,025

Холинхлорид 1,25

Кальциферол 0,25

D-Са-пантотенат 0,025

Фолиевая кислота 0,025

1-инозитол 0,125

Тригидратменафтои- 0,048 бисульфит натрия

Никотиновая кислота 0,0625

Витамин А (ацетат)	0,29
Витамин В12	10,00
Соли
СаС12-2Н20	264,9
КС1	400,0
MgS04-7H20	204,8
NaCl	6800
NaHC03	2200
NaH2PCv2H20	158,3
Другие соединения
Кокарбоксилаза	1.0
Кофермент А	2,0
Дезоксиаденозин • Н20	10,0
Дезоксицитидин-НС1	10,0
Дезоксигуаиозии-НгО	10,0
FAD, двунатриевая	1,00
соль
0-глюкозамин-НС1	3,85
Глюкоза	1000,00
D-глюконолактон	1,80
5-метилцитозин	о,ю
NAD	7,00
NADP, дигидрат нат-	1,00
риевой соли
Ацетат натрия	30,14
Глюкуронат нат-	1,80
рия «НгО
Феноловый красный	20,0
натриевый
Тимидин	10,0
Твин 80	12,50
ИТР, дигидрат тринат-	1,0

риевой соли

Никотинамид 0,0625

гс-Аминобензойная кис- 0,125 лота

Пиридоксаль-HCl 0,0625

Пиридоксин-НС1 0,0625

Рибофлавин 0,025

Тиамин-НС1 0,025

0,Е-а-токоферолфос- 0,025 фат, двунатриевая соль

Аминокислоты

L-аланин

L-aprHHHH-HCl

L-аспарагиновая кислота

L-цистеин-НО • Н₂0

L-цистин

L-глутаминовая кислота

L-глутамин Глицин

L-гистидин-НСЛ • НгО L-гидроксипролин L-изолейцин L-лейцин L-лизин-НС] L-метионин L-фенилаланин L-пролин L-серин L-треонин L-триптофан L-тирозин L-валин Витамины Аскорбиновая кислота Биотин

Са-пантотенат

Холестерин

Холинхлорид

Фолиевая кислота

1-Инозитол

Ниацин

Ниацинамид

л-Аминобензойная кислота

(Parker et al., 1957). мг/л

25,0 70,0 30,0

260,0 20,0 75,0

100,0 50,0 20,0 10,0 20,0 60,0 70,0 15,0 25,0 40,0 25, С 30,0 10,0 40,0 25,0

50,000 0,010 0,010 0,200 0,500 0,010 0,050 0,250 0,025 0,050

Пиридоксаль-НС1 0,025

Пиридоксин-НС1 0,025

Рибофлавин 0,010

Тиамин-НС1 0,010

Неорганические соли

СаС1₂ (безводный) 200,0

КС1 _/ 4С0.0

MgS0₄-7H₂0 200,0

NaCl 6799,0

NaHC0₃ 22С0.0

NaH₂P0₄-H₂0 140,0

Другие компоненты

Кокарбоксилаза 1,0

Кофермент А 2,5

Дезоксиаденозин 10,0

Д езоксицитидин 10,0

Дезоксигуанозин 10,0

Дифосфопиридиннук- 7,0 леотид

Этанол Ю,0

Флавинадениндинук- 1.0 леотид

Глюкоза Ю00,0

Глутатион Ю,1

5-Метилдезоксицити- 0,1 дин

Феноловый красный 20,0

Ацетат натрия-ЗНгО 83,0

Глюкуронат натрияХ 4,2 ХНаО

Тимидин Ю,0

Трифосфопиридиннук- 1,0

леотид

Твин 80 5,0

Уридинтрифосфат 1,0

Среда CMRL 1066

По прописи Паркера и др.

Приложение 2. Красители и фиксаторы

В монографии неоднократно упоминались различные красители и фиксаторы, которые можно найти с помощью предметного указателя. Ниже приведены наиболее часто используемые.

Ацетат-орсеин

— Фиксировать клетки в смеси метанол : уксусная кислота (3:1) и высушить иа воздухе.

— Окрашивать 3—5 мин 2%-ным орсеином в 4%-ной уксусной кислоте.

— Промыть в 40%-ном метаноле и высушить на воздухе.

2. Флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый

К суспензии клеток в СБСР добавить каплю водного 0,01%-ного раствора акридинового оранжевого. При наблюдении в люминесцентном микроскопе ядра обладают зеленой флуоресценцией, а цитоплазма — красной.

3. Фиксатор Карнуа

1 часть ледяной уксусной кислоты 3 части абсолютного этанола

4. Формоловый солевой раствор

— Растворить 5 г NaCl и 15 г NaaSO< в дистиллированной воде и довести объем до 900 мл.

— Отфильтровать 40%-ный формальдегид через бумажный фильтр Грина № 904 1/2 и добавить 100 мл к солевому раствору.

5. Краситель Гимза

— К 30 г красителя Гимза добавить 1980 мл глицерина.

— Прогреть при 56 °С в течение 90—120 мин.

— Добавить 1980 мл метанола н хорошо перемешать.

— Выдержать при комнатной температуре в течение 7 суток и профильтровать через бумажный фильтр Грина № 904 1/2.

Перед использованием развести в соотношении 1/10 забуференной дистиллированной водой или использовать неразведенным.

6". Краситель Грома

а. Метиловый фиолетовый 8 г

6В

Абсолютный этанол 1%-ный водный раствор

80 мл 320 мл

оксалата аммония

б. Иод

Иодид натрия Дистиллированная вода

100 мл 2,5 г 100 мл до 1 л

2 г

1 г

в. Сафранин Этанол

Дистиллированная вода

— Нанести раствор метилового фиолетового (а) на фиксированные препараты и удалить его через 30 с.

— Промыть проточной водой.

— Поместить препарат на 1 мин в раствор йода (б).

— Промыть водой и обесцвечивать этанолом, пока краситель не перестанет отмываться.

— Опустить на 2 мин в раствор противокрасителя, сафранина (в).

— Промыть водой и высушить при комнатной температуре.

— Исследовать в микроскопе под масляной иммерсией.

7. Гематоксилин и эозин

Гематоксилин растворяют в 95%-ном этаноле и к 6 мл 17%-ного раствора добавляют 100 мл насыщенного раствора аммониевых квасцов и 0,5 г оксида ртути. После кипячения и охлаждения добавляют 25 мг глицерина и 25 мл метанола; получившуюся смесь фильтруют.

— Окрасить фиксированные клетки в течение ночи в растворе гематоксилина, разведенном в 100 раз.

— Промыть водой в течение 15 мин.

— Окрасить в 0,5%-ном эозине Y в течение 0,5—1 мин и ополоснуть.

— Обезводить в 95%-ном и абсолютном этанолах.

Ядра окрашиваются в голубой, а цитоплазма в красный цвет.

8. Окраска по Лейшману

— К 7,5 г красителя Лейшмана добавить 5 л метанола и периодически встряхивать в течение 5 суток перед использованием.

9. Окраска по Мэй-Грюнвальд — Гимза

— Смешать 9 мл раствора Гимза (0,3%-ный раствор в глицерине, метаноле) с 90 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8 и добавить 1 мл красителя Мэй-Грюнвальд (0,25% в метаноле; вес/объем).

10. Метиленовый синий

Краситель представляет собой смесь 30 мл насыщенного этанольного раствора метиленового синего со 100 мл 0,01%-ного водного КОН.

— Окрасить препараты в течение 3 мин и промыть водой.

— Насухо промокнуть фильтровальной бумагой и исследовать под масляной иммерсией.

При окрашивании этим красителем все бактерии лучше видны при использовании объективов с большим увеличением.

11. Окраска орсеином

2%-ный раствор природного орсеина (Curr) в 60%-ной ледяной уксусной кислоте готовят, растворяя орсеин в кипящей ледяной уксусной кислоте при помешивании. Раствор охлаждают до 55 °С и добавляют дистиллированную воду, чтобы концентрация кислоты снизилась до 60%. Раствор охлаждают до комнатной температуры и дважды фильтруют через фильтровальную бумагу ватман № 1.

Приложение 3. Фирмы, поставляющие

приборы и реактивы

Ниже перечислены фирмы, с которыми автор имел контакты по ходу своей работы. Список не является исчерпывающим и наличие в списке той или иной фирмы отнюдь не означает, что автор рекомендует использовать продукцию

именно этой фирмы. Среди фирм-поставщиков и их агентов преобладают британские и шотландские фирмы, что также основано преимущественно на личном опыте автора. Более подробная информация может быть получена в Laboratory Equipment Directory, ежегодно публикуемом Morgan-Grampian Book Publishing Co. Ltd., 30 Calderwood St., London, SE15, 6QH.

Abbot Laboratories, North Chicago, II, USA. American Type Tissue Collection, Rockville, MD 20852, USA. Amicon Ltd., 57 Queen's Road, High Wycombe, Bucks. Anderman and Co. Ltd., Central Avenue, East Molesey, Surrey KT8 OQZ. Becton Dickinson U. K. Ltd., (Falcon Plastics) York House, Empire Way, Wembley, Middlesex HA9 OPS. Belloo, see A. R. Horwell Ltd.

A and J. Beveridge Ltd., 5 Bonnington Road Lane, Edinburgh EH6 5BP. Bioassay Systems (L. H. Engineering Co. Ltd.) Bells Hill, Stoke Poges, Bucks, SL2 4EG.

Bio-Rad Laboratories Ltd., Caxton Way, Holywell Industrial Estate, Watford,

Herts. WD1 8RP. British Drug Houses Ltd., Poole, Dorset BHli2 4 NN. British Oxygen Co., 150 Polmadie Road, Glasgow G5. A. Browne Ltd., Chancery House, Abbey Gate, Leicester LE4 OAA. Calbiochem Ltd., 79/81 South Street, Biscops Storford, Herts. CM23 3AL. Charles Austen Pums Ltd., 100 Royston Road, Byfleet, Surrey. Connaught Laboratories, see A. R. Horwell Ltd. Cornig Ltd., Halstead, Essex C09 2DX.

Coulter Electronics Ltd., Coldharbour Lane, Hanpenden, Herts. AL5 4UN. Decon Laboratories Ltd., Ellen Street, Portslade, Brighton BN4 IEQ. Difco Laboratories, P. O. Box No. I4B, Central' Avenue, East Molesey, Surrey KT8 OSE.

Distillers Co., Ltd., Port Dundas Distillery, 74, North Canal Bank Street, Glasgow G4.

Dow Corning Co., see McFarlane Robson. Durham Chemical Distributors, Birtley, Tyne and Weir. Dynatech Labs. Ltd., see Gibco-Biocult. Elga Group, Lane End. High Wycombe, Bucks. Epsom Glass Industries Ltd., see McFarlane Robson. Evans Medical Supplies Ltd., Ruislip, London. Falcon Plastics, see Becton Dickinson U. K. Ltd. Fisons Scientific Apparatus Ltd., Loughborough, Leics. LE11 ORG. Flow Laboratories, Victoria Park, Heatherhouse Road, Irvine, Ayrshire. 'Forma C0₂ Incubators-Raven Scientific Ltd., P. O. Box 2, Haverhill, Suffolk. A. Gallenkamp and Co. Ltd., Braeview Place, Nerston, East Kilbride Glasgow G74 3XJ.

Gelman Hawksley and Sons Ltd., Harrenden Road, Brackmills, Northampton. Gibco-Biocult Labs. Ltd., 3 Washington Road, Sandyford Industrial Estate, Paisley РАЗ 4EP. Glaxo Laboratories Ltd., Greenford, Middlesex. Grant Instruments Ltd., Barrington, Cambridge CB2 5QZ. Green's Filter Paper, see Whatman Lab. Sales Ltd. G. T. Gurr Ltd., see Searle Scientific Services. W. C. Haraeus GmbH, Postfach 169, D6450 Hanau.

Hoechst U. K. Ltd., Hoechst House, Salisbury Road, Hounslow, Middlesex TW4 6JH.

Hopkin and Williams, P. O. Box 1, Romford, RM1 1HA.

A. R. Horwell (Bellco) 2, Grangeway, Kilburn Hing Road, London NW6 2BP. Hotpack Ltd., see Gibco-Biocult.

V. A. Howe and Co. Ltd., 88, Peterborough Road, London SW6 3EP. Hyflo Pums, see Metcalf Bros. Ltd.

Ilford Ltd. — Hamilton Tait Ltd., Polimadie Industrial Estate, Toryglen Street,

Glasgow G5 OBH, or Ilford, London. Kodak Ltd. (Northern Region) Dallimore Road, Wythenshawe, Manchester M23

9NJ, or Acornfield Road, Kirby Liverpool L33 7UX. LEEC-Private Road No. 7, Colwick Estates, Nottingham NG4 2AJ. ^v Linbro, see Flow Laboratories. Luckham Ltd., Labro Works, Victoria Gardens, Burgess Hill, Sussex RH15 9QV. 3M Co. Ltd., see McFarlane Robson. May and Baker Ltd., Dagenham, Essex.

McFarlane Robson Ltd., Burnfield Avenue, Thornliebank, Glasgow G46 7TP. Metcalf Bros Ltd., Cranbourne Road, Potters Bar, Herts.

Millipore (U. K.) Ltd., Millipore House, Abbey Road, Park Royal, London NW10 7SP.

New Brunswick Scientific (U. K.) Ltd., 40 Wellington Street, London WC2E 7BD.

Nunc, see Gibco-Biocult.

Nutritional Biochemical Corp., see Uniscience Ltd. Olympus Microscopes, see Gallenkamp. Oxoid Ltd., Wade Road, Basingstoke, Hants. RG24 OPW. Petriperm, see W. C. Haraeus GmbH.

Pharmacia (G. B.) Ltd., Paramount House, 75 Uxbridge Road, Ealing, London W5 58S.

W. R. Prior and Co. Ltd., London Road, Bishop's Stortford, Herts.

Quickfit and Quartz Ltd., see McFarlane Robson.

Repelcote, see Hopkin and Williams.

Sartorious Ltd., see V. A. Howe.

Schleicher and Schuell Ltd., see Anderman and Co. Ltd.

Searle Scientific Services, Coronation Road, Cressex, High Wycombe, Bucks. Sigma London Chem. Co. Ltd., Fancy Road, Poole, Dorset BH17 7NH. Techmation Ltd., 58 Edware Way, Edware HA8 8JP. " Titertek, see Flow Laboratories. Union Carbide (U. K.) Ltd., Redworth Way, Aycliffe Industrial Est. Aycliffe. Co. Durham.

Uniscience Ltd., Uniscience House, 8 Jesus Lange, Cambridge СВб 8BA. Vir Tis Co. Inc., Gardiner, New York 12525, see Techmation Ltd. Voss Instruments Ltd., Faraday Works, High Street Maiden, Essex CM9, 7EY. Whatman Labsales Ltd. (Reeve Angel), c/o East Anglia Chemicals Ltd., Lady

Lane Industrial Estate, Hadleigh, Ipswich IP7 6BQ. Wild Heerbrugg Ltd., CH-9435 Heerbrugg, Switzerland. R. and J. Wood Ltd., 39 Back Sneddon St., Paisley РАЗ 2DE, Scotland.

Приложение 4. Проверка стерильности

/. Бульон с экстрактом сердца крупного рогатого скота

— Добавить 50 г экстракта сердца крупного рогатого скота (Difco Labs., Detroit) к 900 мл дистиллированной воды при 50 °С. Выдержать в течение часа.

— Медленно довести до кипения.

— Профильтровать через двойной слой фильтровальной бумаги ватман № 12.

— Разлить в бутыли и стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм в течение 15 мин.

2. Бульон с экстрактом сердца и мозга

— Растворить 37 г высушенного экстракта мозга и сердца (Oxoid, Basingstoke) в I л дистиллированной воды.

— Разлить по 25 и 40 мл в 2-унциевые плоские медицинские флаконы.

— Стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм в течение 15 мин.

— Хранить при комнатной температуре.

3. Жидкая среда Саборада

— Растворить 30 г исходной жидкой среды Саборада (Oxoid; приложение 3) в 1 л дистиллированной воды.

— Разлить по 25 и 40 мл в 2-унциевые плоские медицинские бутыли.

— Стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм 15 мин.

— Хранить при комнатной температуре.

4. Пластинки с кровяным агаром

— Растворить 40 г исходного кровяного агара (Oxoid, Basingstoke) в 1 л дистиллированной воды в кипящей водяной бане.

— Аликвоты в 50 мл автоклавировать при 121 °С в течение 15 мин. •

— К 50 мл исходного агара (нагретого до плавления и охлажденного до 45 °С) добавить 5 мл лошадиной сыворотки.

— Разлить по 5 мл в чашки Петри диаметром 50 мм и дать остыть. Лошадиная сыворотка может поставляться регулярно, т. е. 1 раз в две недели фирмой Oxoid Ltd. Bisingstoke.

5. PPLO-агар

A. Исходный PPLO-агар

— Для приготовления 1 л исходного PPLO-arapa смешать 34,0 г бакто-PPLO-агара (Difco Labs.) с 1 л холодной дистиллированной воды и инкубировать сосуд в кипящей водяной бане вплоть до расплавления агара.

— Расплавленный агар разнести по 25 мл в 4-унциевые медицинские плоские флаконы.

— Стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм в течение 15 мин.

— Хранить при комнатной температуре.

Б. Пластинки с PPLO-агаром на 10 пластинок (мл)

Исходный PPLO-arap 25

Лошадиная сыворотка 7,5

Дрожжевой экстракт (см. ниже) 3,75

Триптозофосфатный бульон 3,75

Ацетат таллия (1,25%) 0,4

Пенициллин 0,15

— Нагреть агар в водяной бане до плавления и поддерживать при 45 °С.

— Нагреть сыворотку и дрожжевой экстракт до 45 °С.

— Добавить к агару лошадиную сыворотку, триптозофосфатный бульон, дрожжевой экстракт, ацетат таллия и пенициллин.

— Тщательно размешать и разнести по 4 мл в чашки Петри диаметром 50 мм.

— Дать затвердеть и хранить при 4 °С.

B. Дрожжевой экстракт

— Добавить 250 г сухих пекарских дрожжей в 1 л дистиллированной воды и довести до кипения.

— Профильтровать через двойной слой фильтровальной бумаги ватман № 12.

— Добавить NaOH, доведя рН до 8,0, разлить во флаконы по 10 мл, автоклавировать и хранить при —20 °С.

6. Среда с соевым пептоном и диализатом дрожжей (Kenny, 1973).

А. Исходный бульон

Соевый пептон (Sheffield Chem. Co. 30 г Norwich, NY)

NaCl 5 г

H₂0 1 л

Довести рН до 7,4 и, если требуется исходный агар, добавить 10 г агара Нобль Дифко.

Автоклавировать и хранить при комнатной температуре. Б. Дрожжевой диализат.

450 г активных сухих Флейшманновских дрожжей добавить к 1250 мл Н₂0 и автоклавировать в течение 5 мнн при 121 °С. Диализовать раствор против 1 л воды при 4 °С в течение 2 суток; диализат автоклавировать и хранить в замо-

роженном виде. В. Полная среда

Исходный бульон (или агар) 65 мл

Дрожжевой диализат 10 мл

Лошадиная сыворотка 25 мл Пенициллин 20 000 ед.

Ацетат таллия (3,3%) 1 мл

Включение в среду аргинина (16 мМ) и фенолового красного (0,4 мг%) позволяет выявлять аргининдезаминазу по образованию щелочи, дающей пурпурную окраску.

Приложение 5. Испытания

/. Определение содержания ДНК, РНК и белка.

Используя описанную ниже процедуру, можно определять содержание ДНК, РНК и белка в одном и том же препарате клеток.

а. Собрать клетки трнпсинизацией и определить их количество с помощью гемоцитометра (разд. 8.2) или электронного счетчика клеток (разд. 8.2.2).

б. Дважды промыть клеточную суспензию в ФСБ для удаления внеклеточного белка и затем дважды проэкстрагировать холодной 5%-ной ТХУ для удаления кислоторастворимого материала.

в. Растворить примерно 10⁷ клеток в 1 мл 0,10 н. NaOH (в случае необходимости нагреть до 40 °С).

г. 0,15 мл раствора клеток смешать с 2,85 мл 0,7 н. NaOH и использовать для определения содержания белка (см. ниже).

д. К оставшимся 0,85 мл раствора добавить 0,15 мл 3,3 н. хлорной кислоты. Инкубировать при 70 °С в течение 30 мин. Центрифугировать и определить в надосадочной фракции (высокотемпературный кислотный экстракт) содержание ДНК и РНК.

А. Определение содержания ДНК

Приготовить дифениламиновый реактив по Бартону (Burton, 1956). Для этого к 500 мл ледяной уксусной кислоты добавить 7,5 мл концентрированной серной кислоты и 7,5 г дифениламина. Тщательно перемешать и хранить в бан-

ке из темного стекла при комнатной температуре. Перед использованием к 20 мл этой смеси добавить 0,1 мл 1,6%-ного ацетальдегида.

— Аликвоты высокотемпературного кислотного экстракта разнести по 0,4 мл в пробирки и добавить 0,5 н. хлорной кислоты до объема 1 мл.

— Добавить по 2 мл дифениламинового реактива и перемешать.

— Закрыть пробками и инкубировать при 30 °С в течение 18—48 ч. Определить поглощение при 600 нм.

Стандартный раствор ДНК можно приготовить, растворив нативную ДНК в 50 мМ КС1; концентрацию ДНК можно определить по спектру поглощения (Hirschman, Felsenfeld, 1966). У ДНК тимуса теленка, растворенной до концентрации 1 мг/мл, значение Е₂во равно 18,5. Затем к стандартному раствору ДНК добавляют хлорную кислоту до концентрации 0,5 н. и раствор инкубируют при 70 °С в течение 30 мин для гидролиза ДНК. Раствор разбавляют 0,5 н. хлорной кислотой до концентрации ДНК 100 мкг/мл и различные аликвоты раствора объемом до 1,0 мл используют, как описано выше, для получения стандартной кривой.

Б. Определение содержания РНК

Стандартный раствор РНК готовят, растворив РНК в 0,05 М NaOH до концентрации 50 мкг/мл.

— Аликвоты (0,2 мл) высокотемпературного кислотного экстракта разнести по большим пробиркам (6X5/8 дюйма¹) и добавить воды до 1,5 мл. Для построения стандартной кривой использовать объемы стандартных растворов РНК до 1,5 мл.

— В каждую пробирку добавить 1,5 мл 0,03%-ного раствора FeCl₃ в концентрированной НС1 и 0,1 мл свежеприготовленного 20%-ного раствора орци-нола в 95%-ном этаноле.

— Тщательно перемешать и инкубировать в силькокипящей водяной бане в течение 30 мин. Использовать стеклянные «слёзки» для предотвращения испарения жидкости.

— Охладить в ледяной бане и определить поглощение при 665 нм.

В. Определение содержания белка

Этот метод является модификацией метода Лоури (Lowry et al., 1951). Реактив Фолина — Чиокальто может быть получен от фирмы British Drug House Ltd. (приложение 3). Перед использованием его следует довести до концентрации 2 н. Раствор А готовят в день анализа путем последовательного добавления к 100 мл 13%-ного Na₂C0₃, 3 мл 4%-ного NaK-тартрата (NaKC₄H₄0₆X Х4Н₂0; соль Рошеле) и 3 мл 2%-ного CuS0₄«5H₂0 и немедленного перемешивания. В качестве стандарта используется бычий сывороточный альбумин (150 мкг/мл).

— Аликвоты (0,2 и 0,6 мл раствора клеток; см. выше 1, г) внести в пробирки и довести объем до 1,5 мл 0,66 н. NaOH.

— Добавить по 1,5 мл раствора А и перемешать.

— Спустя точно 10 мин добавить 0,5 мл реактива Фолина — Чиокальто с помощью пипетки на выдувание объемом 0,5 мл и сразу после этого тщательно перемешать.

— Инкубировать при комнатной температуре 30 мин и определить поглощение при 625 нм.

2. Флуоресцентные методы определения содержания ДНК

Чувствительность дифениламинового метода можно увеличить снижением объема реакционной смеси, но существуют флуоресцентные методы с использованием диаминобензойной кислоты (Kissane, Robins, 1958; Hinegardner, 1971)

1 дюйм соответствует 2,54 см. — Прим. ред.

или бромида этидия (Klotz, Zimm, 1972), чувствительность которых позволяет определять 0,1 мкг ДНК. В методе Хинегарднера обессоленную ДНК высушивают в силиконизированной пробирке и затем инкубируют при 60 °С в течение 45 мин с 0,1 мл переочищенной диаминобензойной кислоты (0,4 г/мл воды). Затем в пробирку добавляют 1,5 мл 1 н. HCI и измеряют флуоресценцию при 500 нм (комбинация запирающих фильтров 2А-12 и 65А) при длине волны возбуждающего света 410 нм (первичный фильтр 405). Этот метод можно применять непосредственно к клеткам. После просчета количества клеток суспензию фиксируют 10%-иым нейтральным формалином, забуференным до рН 8 с помощью 0,1 М бората, и клетки перед высушиванием несколько раз промывают водой. Если испытываются несколько разных объемов одной и той же суспензии, то наклон кривой (зависимость эмиссии от объема) может служить мерой концентрации ДНК.

Приложение 6

Сокращения
АКТГ	адренокортикотропный гормон
БОЕ	бляшкообразующая единица
БСИ	базальная среда Игла
ВВС	вирус везикулярного стоматита
вгп	вирус герпеса простого
ВНБ	вирус ньюкастлской болезни
BCP	вирус саркомы Рауса
ГАЕ	гем-агглютинирующая единица
ГФРТ	гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза
Декон	детергент
ДФО	дифенилоксазол
KMC	кальгонметасиликат
Л KMC	лишенный кальция и магния СБСР
MBM	мелкий вирус мышей
ми	митотический индекс
МСИ	минимальная среда Игла
МСИ 10	минимальная среда Игла с 10% сыворотки теленка
МСИП	минимальная среда Игла с сывороткой плода крупного
МСИТС	рогатого скота
	минимальная среда Игла с триптозофосфатом (10%) и
	сывороткой теленка (10%).
СБСР	сбалансированный буферный солевой раствор
СТГ	соматотропный гормон (гормон роста)
ТРИТЦ	тетраметилродаминизотиоцианат
ТХУ	трихлоруксусная кислота
ФГА	фитогемагглютинин
ФИТЦ	флуоресцеинизотиоциаиат
ФРФ	фактор роста фибробластов
ФСБ	фосфатный солевой буфер
хк	хлорная кислота
цпэ .	цитопатогенный эффект
ЭДТА	этилендиаминотетраацетат (версен)

эмс

ЭРФ Ad2

AMP, ADP, ATP АТСС

ВНК-клетки BUdr

СНО-клетки CMP, CDP, CTP CMRL

dAMP, dTMP De Pex

GMP, GDP, GTP GS-фильтр

НАТ-среда

Нер-клетки HTC-клетки Methocel

MNNG МОРС

MSE

NCTC

PPLO PyY-клетки

RPMI

S-фаза

SV40

Т-антиген

/Gl, tG2, tS и *M

ts-мутант

UMP, UDP, UTP

7X

этилметансульфонат эпидермальный ростовой фактор

аденовирус 2

аденозинмоно-, аденозинди- и аденозинтрифосфат American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур) линия клеток почки новорожденного хомячка бромдезоксиуридин

линия клеток яичников китайского хомячка цитидинмоно-, цитидинди- и цитидинтрифосфат

Connaught Medical Research Laboratories (лаборатории

медицинских исследований в Коннауте) дезоксиаденозинмонофосфат, дезокситимидинмоиофосфат

и т. д.

среда для заключения препаратов, поставляемая фирмой G. Т. Gurr Ltd. (приложение 3)

гуанозинмоно-, гуанозинди- и гуанозинтрифосфат

мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, поставляемый фирмой Millipore Corp.

культуральная среда с добавкой гипоксантина, аминоптерина и тимидина

линия эпителиальных клеток ^человека

линия культивируемых клеток гепатомы карбоксиметилцеллюлоза типа МС (4000 сПз), поставляемая фирмой Dow Chemical Co.

Ы-метил-№-нитро-М-нитрозогуанидин линия клеток плазмацитомы, индуцированной минеральным маслом

фирма, поставляющая медицинское и научное оборудование (Medical and Scientific Equipment Ltd.)

National Cancer Tissue Culture (коллекция клеточных культур Национального института раковых исследований, США)

микоплазма, плевропневмониеподобный организм

линия клеток ВНК, трансформированных вирусом по-лиомы

Roswell Park Memorial Institute (научно-исследовательский институт в США)

фаза синтеза ДНК в клеточном цикле обезьяний вирус 40

трансплантационный антиген

продолжительность фаз клеточного цикла Gl, G2, S и М соответственно

температурочувствительный мутант

урндинмоно-, уридинди- и уридинтрифосфат

детергент

< Дифференцировка в культурах клеток