Синхронизация клеток

Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

При необходимости получить популяцию клеток, находящихся в одной и той же фазе клеточного цикла, используются два различных принципа.

а. Можно блокировать клетки таким образом, чтобы они накапливались на специфической стадии цикла. Блокировка может быть химической или физиологической, но оба метода имеют тот недостаток, что клетки подвергаются неблагоприятному воздействию и в результате становятся по некоторым параметрам аномальными (см., однако, разд. 11.7).

Клетки, растущие в монослое, при делении принимают форму шара. Поэтому во время митоза они оказываются менее прочно прикрепленными к субстрату и могут быть легко отделены от него (Terasima, Tolmach, 1961, 1963; Robbins, Marcus, 1964; Peterson et al., 1968; Schall, 1973a).

При работе этим методом используются экспоненциально растущие клетки, и важно на протяжении всей процедуры селекции поддерживать постоянное значение рН и температуры.

Этот метод был использован применительно к клеткам СНО, растущим в среде Мак-Коя с 20% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота в буфере Hepes (Klevecz et al., 1974, 1975). Клетки культивировали в этой среде при 37 °С и отбирали клетки, среди которых 98—99% находились в стадии митоза. Жизнеспособность отобранных клеток достигала 100%, и при пересеве половина клеток прикреплялась к подложке в течение 1 ч, а максимальное прикрепление достигалось в течение четырех часов (Klevecz, 1975). В этих опытах, однако, отбиралась очень малая часть исходных клеток. Сила прикрепления различных типов клеток к субстрату оказывается различной, так что для различных типов клеток следует, возможно, использовать модификации приводимых здесь методик отбора.

11.2.1. Встряхивание

— Высеять клетки в бутыли за 24 ч до первичного отбора. При работе с линией фибробластов китайского хомячка Don-C можно высевать 5-Ю⁷ клеток во вращающиеся бутыли в среде Мак-Коя (см. разд. 11.2.2).

— Через 24 ч встряхнуть бутыль с клетками (исходно должно быть не менее 10⁷ клеток) и удалить среду, содержащую мертвые клетки и их обломки. Встряхивание лучше всего производить в водяной бане на качалке так, чтобы бутыль встряхивалась 20 раз в течение 3 с; весь клеточный монослой должен при этом быть покрыт средой. Сила прикрепления к субстрату у различных линий клеток варьирует в широких пределах, и, следовательно, для каждого случая требуется экспериментально подбирать интенсивность встряхивания.

■— Добавить свежую прогретую среду (избегать пипетирования среды на клеточный монослой) и инкубировать в течение 15, 30, 45 мин и т. д. Интервалы между сборами клеток для разных линий клеток различны.

— Собирать слабо прикрепленные клетки путем встряхивания, как указывалось выше, но в этот раз собирать среду в сосуды в ледяной бане, объединяя все сборы.

— Осадить клетки при 700g в течение 3 мин.

— Высеять митотические клетки (~10⁵ клеток на чашку диаметром 5 см). Клетки прикрепляются в подложке и делятся в течение часа.

Хотя выход митотических клеток низок (1—3%), он может быть увеличен удлинением срока сбора клеток до 2—3 ч.

Другой путь увеличения выхода митотических клеток — это накопление клеток в метафазе после кратковременной обработки колцемидом. При пересеве линии фибробластов китайского хомячка Don-C каждые 24 ч (Stubblefield et al., 1967) была получена частичная синхронизация клеток с пиками митозов че-

рез 7 и 19 ч после посева. При добавлении колцемида через 18 ч после посева и отбора митотических клеток через 22 ч выход клеток составляет 21% популяции, причем 86% этих клеток оказываются в метафазе. Эти клетки нормально растут и не отличаются от контрольных клеток по продолжительности митоза и времени генерации, кинетике синтеза ДНК и величине пролиферативного пула. Этот метод, однако, не является универсальным, поскольку обратимость действия колцемида реализуется не во всех клеточных культурах.

11.2.2. Трипсинизация

Было показано (Stublefield et al., 1967), что при использовании разбавленного трипсина чистота получаемых митотических клеток оказывается выше, чем при встряхивании. Отбор митотических клеток с помощью разбавленного трипсина производят следующим образом:

— Пересеивать клетки Don-C каждые 24 ч в среде Мак-Коя 5а (приложение 1), содержащей 20% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и 0,08% гидролизата альбумина. Плотность посева клеток 1,2 -10⁵ клеток в 1 мл (3 -10⁴ клеток на 1 см²).

— Через 18 ч после посева добавить колцемид (0,06 мкг/мл) и продолжить инкубацию в течение 4 ч. Некоторые митотиче-скиё клетки открепляются от субстрата в ходе инкубации и должны быть объединены с клетками, открепляющимися при трипсинизации.

— Удалить среду и заменить ее 0,1%-ным холодным трипсином в ФСБ.

- — Слегка встряхнуть культуральный сосуд (2 цикла в секунду) либо вручную, либо на качалке в водяной бане.

— Через 45 с перенести суспензию митотических клеток в центрифужные пробирки, осадить клетки при 400g в течение 2 мин и ресуспендировать в свежей среде до концентрации 4-10* клетка/мл.

— Через 20—30 мин посеянные клетки синхронно делятся. Этот метод не является универсальным для всех клеточных линий, поскольку действие колцемида не во всех случаях оказывается обратимым.

11.3. Избирательная гибель клеток

в одной из фаз клеточного цикла

Этот метод обычно основан на использовании либо тритирован-ного тимидина с высокой удельной радиоактивностью (Whitmo-ге, Culyas, 1966) (данный вариант применим для широкого круга клеток), либо гидроксимочевины (Sinclair, 1965) (данный

вариант применим только к некоторым, чувствительным, линиям клеток).

В основе метода лежит гибель клеток в определенной фазе клеточного цикла, что приводит к избирательному отбору клеток, находящихся вне фазы-мишени. При экспоненциальном росте клеток и прохождении клеток по клеточному циклу увеличение периода экспозиции приводит к снижению количества выживающих клеток и ширины диапазона клеточного цикла, в котором оказываются выживающие клетки. Однако такой вариант возможен только в теории, а на практике при инкубации в условиях, приводящих к 90%-ной гибели клеток, выжившие клетки вместо того, чтобы концентрироваться на границе фазы S, замедляют свой рост, и требуется несколько часов для их последующего вхождения в фазу S, так что при вхождении в фазу G2 синхронизация популяции клеток теряется.

Главный недостаток этих методов заключается в том, что погибшие клетки, хотя и теряют способность к делению, но в течение значительного времени сохраняют способность к метаболизму, что затрудняет проведение биохимических исследований.

Митотические клетки могут быть избирательно удаляемы в течение длительного периода времени. В результате популяция остающихся клеток оказывается обогащенной клетками в фазе G2 (Stublefield, 1964; Creasey, Markiw, 1965; Pfeiffer, Tolmach, 1967). К сожалению, помимо опасности отбора популяции медленно растущих клеток, использование подавляющих митоз колхицина, колцемида и винбластина приводит и к другим эффектам, например к подавлению синтеза клеточной РНК.

11.4. Отбор клеток по размеру

11.4.1. Отбор клеток в электронном счетчике

Более подробно основы этого метода рассматриваются в разд. 10.7.5. Для разделения клеток используется модифицированный электронный счетчик, т. е. счетчик Коултера, сопряженный с анализатором амплитуды импульсов и электронным клеточным сортировщиком. Эта система способна разделять клетки на различное число классов со скоростью 50 000 клеток в минуту. Клетки сохраняют жизнеспособноость, и время их генерации при разделении не меняется (Fulwyler, 1965; Van Dilla et al., 1967). Однако из-за высокой стоимости установки и относительно низкой скорости разделения этот метод к настоящему времени не получил широкого распространения в биохимии. Альтернативный метод использования электронного счетчика клеток для их разделения по размеру основан на измерении рассеянного света лазерного луча (разд. 10.7.5).

11.4.2. Зональное центрифугирование

Скорость оседания клеток зависит от их плотности и размера. Следовательно, относительно легко разделить клетки различного типа, различающиеся по плотности, но значительно труднее разделить клетки одного типа, находящиеся на различных фазах клеточного цикла, поскольку в этом случае скорость их седиментации (мм/ч) будет приблизительно пропорциональна г²/4, где г — радиус клетки в микрометрах. На разных стадиях клеточного цикла объем клеток различается не более чем в два раза, а следовательно, различия в радиусе клеток не могут превышать 1,6.

Стабилизация седиментирующих клеток достигается с помощью градиента, и для создания такого градиента используются обычно сыворотка или фиколл (Pharmacia Ltd.) (Boone et al., 1968; Miller, Phillips, 1969; Macdonald, Miller, 1970; Warmsley, Pasternak, 1970). Для создания градиента используется также сахароза (Sinclair, Bishop, 1965; Morris et al., 1967; Shall, McCleland, 1971; Shall, 1973b), но в этом случае может пострадать жизнеспособность клеток, если не приняты специальные меры предосторожности для поддержания изотоничности раствора.

При центрифугировании клеток (Boone et al., 1968) через прерывистый (10—20%) градиент фиколла в МСИ, модифицированной для этой цели (удалены кальций и бикарбонат и концентрация фосфата увеличена в 10 раз), в зональном центрифужном роторе А=1Х в течение 1) ч при 1000 об/мин при 20 °С удается получить четкое разделение различных типов клеток (клетки HeLa и тимоциты кролика).

Использование центрифуги для увеличения ' скорости седиментации клеток мы находим и в других работах (Sinclair, Bishop, 1965; Morris et al., 1967). Однако Шэлл (Shall, 1973b), a также Миллер и Филлипс (Miller, Phillips, 1969) использовали седиментацию в поле силы тяжести; в обеих работах описаны простые установки для создания градиента и разделения клеток. Установка Шэлла позволяет одновременно разделять 10⁹ клеток, а в установке Миллера и Филлипса можно одновременно разделять 3-Ю⁸ клеток. Аппараты Шэлла и Миллера и Филлипса весьма сходны; на рис. 11.1 представлена схема такой установки. В случае изготовления из стекла такую установку можно стерилизовать автоклавированием (при этом открытые концы трубок и резервуаров следует закрывать алюминиевой фольгой), и разделяемые на установке клетки могут быть использованы для дальнейшего выращивания в культурах.

Градиент создается из двух растворов. Резервуар Ai содержит либо 10%-ную (вес/объем) сахарозу в полной среде, в которой концентрация NaCl снижена до 146 мМ для поддержания

Рис. 11.1. Аппарат для отбора клеток путем осаждения в поле земного тяготения (описание см. в тексте). М — магнитная мешалка.

постоянного осмотического давления, либо 30%-ную сыворотку эмбриона крупного рогатого скота в ФСБ. Резервуар А₂ содержит соответственно либо 2,72%-ную (вес/объем) сахарозу в полной среде с концентрацией NaCl, сниженной до 40 мМ, либо 15%-ную сыворотку в ФСБ. Объемы, а следовательно, и высоты столбов жидкостей в каждом резервуаре должны быть одинаковыми (обычно по 250 мл на резервуар).

— При закрытом кране Ж открыть кран 3 и включить магнитную мешалку М, вращающую магнит в резервуаре А₂. Магнит должен вращаться быстро, чтобы обеспечить эффективное перемешивание компонентов.

— Внести в Б 10—30 мл а) не содержащей сыворотки среды или б) ФСБ и дать стечь жидкости в резервуар В для удаления пузырьков воздуха.

— Внести в Б суспензию клеток (10—20 мл) в ростовой среде с 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и дать суспензии стечь в резервуар В, где она образует тонкий слой под присутствующими там средой или ФСБ.

— Не впуская в систему воздух, позволить градиенту вытекать из А в резервуар В. Дефлектор Г предотвращает впрыскивание раствора в В, которое могло бы привести к перемешиванию слоя клеточной суспензии. Около 500 мл градиента должны быть введены в резервуар В со скоростью 30— 40 мл/мин. Скорость тока жидкости контролируется краном Е (Quickfit and Quart Ltd.). Резервуар В должен содержать около 100 мл жидкости на каждый сантиметр высоты.

— Отстаивать 2—4 ч. Чем ниже температура, тем больше вязкость, следовательно, медленнее седиментация клеток. Однако если время седиментации достаточно продолжительно по сравнению с временем генерации, то лучше разделять

клетки при 4°С. Если на градиенте наслоено слишком большое количество клеток, то возможно их «проваливание».

— Используя трехходовой кран Д, дать разделенным клеткам вытекать из резервуара В. Отбросить среду, содержащуюся в конической части В, и далее собирать фракции по 15 мл. Известна более простая модификация аппарата (Macdonald,

Miller, 1970), а также миниатюрный вариант (Shall, 1973b), в котором градиент (15 мл) формируется в трубке размерами 15x1,6 см, а клеточная суспензия (3-10⁷ клеток) наслаивается на него с помощью пипетки с широким кончиком. После отстаивания при 37°С в течение 50 мин отбирается 1 мл жидкости с верхней части, в котором содержатся самые мелкие молодые клетки; после отмывания сахарозы клетки возвращаются в нормальную ростовую среду.

Этот метод позволяет в течение короткого периода времени отбирать большое количество клеток при удовлетворительном сохранении их жизнеспособности. Однако степень синхронизации выделенных клеток ниже, чем при отборе митотических клеток.

11.5. Синхронизация пересевом

Часто бывает трудно избежать некоторой синхронизации культивируемых клеток просто в результате рутинных манипуляций с клетками. Так. при пересеве клеток Don-C каждые 24 ч создается давление отбора, благоприятствующее клеткам с 12-часовым временем генерации и наиболее высокой частотой митозов через 7 и 19 ч после посева (Stubblefield, 1967).

Чаще всего пересев клеток проводят после выхода клеток из логарифмической стадии pocia, и перехода их в стационарную Дтадша_(разд. 6.2). Это сопровождается частичной спихрониза-цней последующих циклов синтеза ДНК и клеточных делений.

— Установить культуру мышиных клеток L929 в среде Игла (модификация Глазго) с 10% сыворотки теленка и менять среду каждые два дня (рис. 5.2).

— Через 10 дней культивирования пересеять клетки с плотностью посева 2 -10⁵ клеток в 1 мл. Клетки можно высевать на покровные стекла для последующего радиоавтографического анализа или во флаконы Ру для биохимических исследований.

— Инкубировать культуры на покровных клетках с тритированным тимидином (5 мкКи/мл; 5 Кн/ммоль) _в течение 30-ми-нутпых интервалов через различное время после посева. Для этого к 0,5 мл среды добавлять 10 мкл раствора, содержащего 2,5 мкКи ³Н-тимидина в концентрации 50 мкМ.

■— Подготовить клетки для радиоавтографического анализа и

Время после пересева, v

Рис. 11.2. Синтез ДНК в клетках, пересеянных из культуры в стационарной фазе. Мышиные клетки L929 пересевали в чашки диаметром 5 см (4«10⁵ клеток в 5 мл МСИ, содержащей 10% сыворотки теленка). В указанное время клетки инкубировали в течение 1 ч с ³Н-тимидином и определяли его включение в ДНК.

подсчитать относительное количество меченых клеток и ми-тотический индекс (разд. 12.3.1).

В этом эксперименте лишь немногие клетки входят в фазу S в течение 12 ч после посева (рис. 11.2), но к 18 ч около 70% клеток оказываются в фазе синтеза ДНК. Все клетки делятся немногим позднее 24 ч после посева. Это несколько превышает продолжительность нормального клеточного цикла, чему, возможно, два объяснения:

1. Пересев оказывает стимулирующее действие и после короткого лаг-периода клетки проходят всю фазу G1, прежде чем перейти фазу S и вступить в митоз.

2. В течение 12-часового периода происходит рост клеток, и лишь затем вероятность перехода этих клеток возрастает настолько, что они могут перейти из состояния А в фазу В и начать синтез ДНК (разд. 10.4).

Ограничение пространства — важный фактор, лимитирующий рост клеток в полном монослое. Однако ограничение питатель-

иых веществ также имеет важное значение (Dulbecco, Elking-ton, 1973) и лежит в основе следующих двух методов синхронизации.

11.6. Недостаточное содержание сыворотки

Клетки сирийских хомячков ВНК21/С13 прекращают рост в •среде с 0,25% сыворотки (Burk, 1970) и могут поддерживаться в покоящемся состоянии в течение 8 и более суток. При добавлении сыворотки синтез ДНК начинается через 9 ч, а пики митозов наблюдаются через 23 и 33 ч. Можно думать, что клетки задерживаются в фазе G1, и после стимуляции требуется 9-часовой лаг-период, прежде чем клетки войдут в стадию экспоненциального роста с временем генерации около 10—12 ч. Добавление сыворотки на 3 ч (сывороточный импульс) индуцирует прохождение одного клеточного цикла примерно у 50% клеток.

Аналогичные результаты были получены при культивировании куриных фибробластов (Temin, 1970) и мышиных фибропластов ЗТЗ (Todaro et al., 1965).

Обнаружена почти линейная зависимость между продолжительностью действия сыворотки и относительным количеством стимулированных клеток (Brooks, 1976). Присутствие нуклеози-дов усиливает ответ на сыворотку, в результате чего скорость вхождения клеток в фазу S резко увеличивается после лаг-периода. Характер этого изменения позволяет думать, что вхождение клеток в цикл представляет собой неупорядоченный процесс, происходящий с фиксированной вероятностью (Brooks, 1975) —аналог-ично тому, как было предложено Смитом и Мартином (Smith, Martin, 1973, 1974).

Для синхронизации клеток хомячка предлагается следующая процедура:

— Суспендировать клетки ВНК21/С13 при концентрации 10⁶ клеток в 10 мл среды Игла (модификация Глазго), содержащей 10% триптозофосфата, 0,05 мМ L-серин, 0,1 мМ L-оринитин, 0,1 мМ гипоксантин и 0,25% сыворотки теленка, и посеять клетки в чашки диаметром 5 см. У клеток ВНК21/С13 в этих условиях отмечаются очень слабые синтез ДНК и деления, но при посеве в этих условиях трансформированных вирусом полиомы клеток PYY происходят два цикла клеточных делений при низкой концентрации сыворотки.

— Для инициации роста культуры добавить через 100 ч по 0,5 мл сыворотки теленка на чашку.

11.7. Голодание по изолейцину

Было показано, что вступившие в стационарную фазу клетки СНО в среде Хэма F10 могут быть стимулированы к дополнительному циклу клеточного деления путем смены среды. В этом случае ограничение роста обусловлено не факторами сыворотки, а недостатком изолейцина, концентрация которого в среде Хэма F10 составляет лишь 5—10% от его содержания в других средах (Ley, Tobey, 1970; Tobey, Ley, 1970).

Экспоненциально растущие клетки СНО, L929, ВНК21/С13 могут быть перенесены в дефицитную по изолейцину среду, содержащую диализованную сыворотку; в этих условиях они задерживаются в фазе Gl (Tobey, Ley, 1971; Everhart, 1972; Tobey, 1973; Skoog et al., 1973). Скорость синтеза ДНК снижается в течение нескольких часов после того, как клетки помещают в среду с дефицитом изолейцина, и количество клеток за этот период увеличивается на 30% в результате деления клеток, находившихся в фазах S, G2 и митозе. Небольшие количества изолейцина в среде обеспечивают несколько большее увеличение числа клеток (Tobey, 1973). При этом не отмечается признаков несбалансированного роста и биосинтетическая способность клеток поддерживается на значительно более высоком уровне, чем у клеток в стационарной фазе роста культуры (Еп-ger, Tobey, 1972).

Добавление изолейцина приводит к индукции синтеза ДНК у большинства клеток через 4—5 ч, и митотический индекс в культуре клеток СНО начинает увеличиваться через 12 ч.

— Собрать суспензию клеток СНО на стадии экспоненциального роста, промыть их лишенной изолейцина средой Игла.

— Посеять 7,5-10⁵ клеток СНО в чашки диаметром 5 см в МСИ, лишенной изолейцина и содержащей 5% диализован-ной сыворотки эмбриона крупного рогатого скота.

— После инкубации в течение ночи заменить среду на свежую, содержащую изолейцин (2-Ю^-6 М) и 10% недиализованной сыворотки эмбриона крупного рогатого скота.

— Если клетки посеяны на покровные стекла, то при радиоавтографическом анализе после импульсной клетки ³Н-тимиди-ном (5 мкКи/мл) будет обнаружено появление клеток в фазе S через 4 ч после добавления изолейцина.

Механизм действия изолейцинового голодания неясен, однако это не просто отражение общего дефицита аминокислот, поскольку голодание по лейцину вызывает более выраженное подавление клеточного роста без какой-либо синхронизации культуры (Everhart, 1972; Tobey, 1973). Скорее, ответ клеток на изолейциновое голодание может указывать на некоторую неоднородность G1.

Результаты, полученные этим методом, сравнимы с результатами отбора митотических клеток в том смысле, что почти 100% клеток в полученной популяции оказываются на стадии G1. Данный метод проще, чем отбор митотических клеток, и может быть использован применительно к большему числу клеток.

11.8. Блокирование фазы S

Синхронизация клеток на границе фаз G1/S может быть достигнута нарушением синтеза одного или более дезоксирибонук-леозидтрифосфатов, необходимых для синтеза ДНК, при условии, что это нарушение не препятствует протеканию других клеточных процессов, таких, как синтез РНК и белка.

Если блок поддерживается в течение 16 ч (т. е. в течение Т — /5), то около 70% экспоненциально растущей культуры скапливаются в начале фазы S. На практике трудно определить, действительно ли клетки синтезируют ДНК, хотя и с пониженной скоростью, т. е. действительно ли клетки находятся в фазе S. Клетки, находящиеся в фазе S, к началу блока остаются в этой фазе до снятия блока, после чего 70% клеток, находящихся на границе фаз G1 и S, синхронно проходят фазы S и G2 и делятся. Эти синхронизированные клетки часто бывает удобно использовать для изучения событий, происходящих в фазах S и G2. Этот метод, однако, обладает следующими недостатками.

1. Только 70% клеток оказываются синхронизированными, а 30% клеток опережают основную группу клеток на 6 ч и менее.

2. В присутствии агентов, блокирующих синтез ДНК, могут происходить другие события, не являющиеся непосредственным результатом подавления синтеза ДНК.

3. Добавление агентов, блокирующих синтез ДНК, может не влиять на протекание процессов, не связанных непосредственно с синтезом ДНК, так что некоторые аспекты клеточного метаболизма могут отражать активность, присущую клеткам в фазе G2 и даже в G1, хотя события, связанные с синтезом ДНК, задерживаются в присутствии этих агентов на границе фаз G1 и S.

Такой несбалансированный рост, продолжительность которого превышает время генерации, приводит к гибели клеток (Ruekert, Mueller, 1960). Несбалансированный рост характерен для любых клеток, подготовившихся к делению (разд. 10.4), но блокированных по какой-либо функции, — в том числе для клеток, инкубированных с колцемидом в течение более чем нескольких часов. Более того, эффекты, обусловленные избирательным подавлением синтеза ДНК, могут не проявляться

вплоть до освобождения синхронизированных клеток из блока и их вступления в следующую фазу Gl (Firket, Mahieu, 1966; Cress, Gerner, 1977). Было показано, что продолжительность фазы G2 не зависит от продолжительности аминоптеринового блока клеток вплоть до 8 ч инкубации с антиметаболитом.

Первый недостаток метода блокирования клеток в фазе S может быть устранен применением двойного блока. При этом методе агент, блокирующий синтез ДНК, добавляют к клеткам, которые уже обработаны или отобраны таким образом, что все они находятся в фазе G1. Это обеспечивает сбор всех клеток на границе фаз G1/S. Начальный отбор может быть произведен отбором митотических клеток (разд. 11.2) либо путем использования популяции клеток, непосредственно перед этим стимулированных к пролиферации добавлением сыворотки (разд. 11.6), лимитирующей аминокислоты (разд. 11.7), пересевом клеток (разд. 11.5), либо добавлением фитогемагглютинина (разд. 6.2.5). Термин «техника двойного блока», однако, применяется, как правило, к клеткам, у которых и первичный отбор, и установление блока осуществляются сходными методами. Так, для блокирования синтеза ДНК могут использоваться высокие концентрации тимидина (разд. 11.8.3). Если популяцию клеток обработать 3 мМ тимидином в течение 16 ч и затем убрать тимидин, то 70% клеток, находящихся на границе фаз G1/S, и 30% клеток, остановленных в фазе S, начнут движение по циклу, и спустя 8—10 ч все клетки окажутся в фазе G1. Если через 12 ч после снятия блока применить повторный тимидино-вый блок, то все клетки подойдут к началу фазы S и на том остановятся.

На практике для синхронизации клеток на границе фаз G1/S используются как тимидин, так и другие агенты, такие, как аминоптерин, аметоптерин, 5-фтордезоксиуридин или гидро-ксимочевина.

11.8.1. Действие аминоптерина и аметоптерина (метотрексата)

Эти ингибиторы подавляют синтез ДНК вскоре после их добавления к клеткам. Включение ³Н-дезоксиуридина в ДНК снижается до ;3%1 от контроля в течение 15 мин после добавления 10 мкМ аминоптерина; даже при концентрации 0,1 мкМ аминоптерин подавляет синтез ДНК до 20% от исходного в течение 45 мин после добавления (Siegers et al., 1975). Концентрации аметоптерина в диапазоне от 0,1 М до 1 мкМ блокируют синтез тимидилатов, но синтез ДНК продолжается с заметной скоростью, и тимидилатный пул истощается медленно (Adams et al., 1971; Baumunk, Freidman, 1971; Fridland, 1974; Fridland, Brent, 1975).

Аминоптерин и аметоптерин представляют собой 4-аминоана-

логи фолиевой кислоты (рис. 13.3) и, следовательно, являются эффективными ингибиторами дигидрофолятредуктазы (КФ 1.5.1.3) (Blakley, 1969). Этот фермент катализирует восстановление фолиевой кислоты и дигидрофолиевой кислоты до тетрагидрофолиевой кислоты, представляющей собой активный кофермент, участвующий во многих различных звеньях переноса одноуглеродных фрагментов. Как описано в гл. 13, тетрагид-рофолят участвует в метаболизме а) аминокислот глицина и метионина, б) второго и восьмого углеродных атомов пуриново-го кольца, в) метильной группы тимидина, а также принимает непрямое участие в синтезе холина.

Чтобы сконцентрировать эффект добавляемых ядов на метаболизме тимидина, другие их эффекты предотвращаются добавлением в среду гипоксантина или аденозина (30 или 200 мкМ) и глицина (100 мкМ), не считая метионина и холина, уже присутствующих в среде. Пул тетрагидрофолиевой кислоты в клетках достаточно велик, и, помимо синтеза кофермента из витамина, единственным процессом, зависящим от активности дигидрофолятредуктазы, оказывается регенерация тетра-гидрофолята и дигидрофолята в ходе синтеза dTMP, т.е. процесс, протекающий в течение фазы S. Следовательно, истощение пула тетрагидрофолиевой кислоты и накопление дигидрофолиевой кислоты под действием этих ядов происходит только в клетках, находящихся в фазе S. Оказалось, однако, что при выращивании клеток китайского хомячка в среде с 0,25 мкМ аметоптерином в течение 24 ч не происходит накопления в клетках дигидрофолиевой кислоты (McBurney, Whitmore, 1975), и концентрации аметоптерина вплоть до 2,5 мкМ не влияют на синтез глицина, если только клетки не инкубировались в течение предшествующих 48 ч в отсутствие фолиевой кислоты (McBurney, Whitmore, 1975), что приводило к истощению пула тетрагидрофолиевой кислоты. Это позволило авторам предположить, что аминоптерин может оказывать более прямое действие на синтез тимидилатов и пуринов, тем более, что ранее было обнаружено его действие на активность тимидилатсинтетазы (Borsa, Whitmore, 1969). Восстановление фолиевой кислоты оказалось более чувствительным к действию аметоптерина по сравнению с активностью тимидилатсинтетазы (McBurney, Whitmore, 1975), и через 48 ч инкубации клеток с низкими дозами аметоптерина рост клеток ограничивался вследствие инактивации фолятредуктазы. Используя низкие дозы аметоптерина, удалось получить линии мутантных клеток и с их помощью примирить эти две группы данных.

Ингибирующее действие антифолятов может быть снято либо сменой среды (Adams, 1969а, b), либо, что чаще используется, добавлением в среду тимидина, обеспечивающего синтез dTTP под действием ферментов тимидин- и тимидилаткиназьк

11.8.2. Действие 5-фтордезоксиуридина

5-фтордезоксиуридин представляет собой аналог тимидина и может входить в клетки и фосфорилироваться так же, как и тимидин, с образованием 5-фтордезоксиуридинмонофосфата, который является конкурентным ингибитором тимидилатсинтетазы относительно dUMP. Поскольку, однако, он может конкурировать с тимидином за вхождение в клетки и фосфорилирование, не рекомендуется использовать его при количественных оценках синтеза ДНК. Его действие может быть прекращено таким же образом, как и действие антифолятов.

11.8.3. Действие высоких концентраций тимидина

Захваченный клетками тимидин быстро превращается в dTTP, и размер внутриклеточного пула последнего зависит от внеклеточной концентрации тимидина (см. рис. 12.5). Это приводит к заметному влиянию на скорость синтеза ДНК даже столь низкой внеклеточной концентрации тимидина, как 3-Ю^-7 (Cooper et al., 1966). При концентрации тимидина выше 1 мМ подавление синтеза ДНК становится почти что полным (Morris, Fisher, 1960; Xeros, 1962; Bootsma et al., 1964; Studzinski, Lambert, 1969). Имеются, однако, данные о том, что синтез-ДНК проходит со скоростью около 7з от нормальной даже в присутствии 2 мМ тимидина (Bostock et al., 1971), и, как показано на рис. 12.3, для полной остановки роста клеток требуется концентрация тимидина 5 мМ.

Подавление синтеза ДНК обусловлено действием dTTP, который является аллостерическим ингибитором рибонуклеотидре-дуктазы (Reichard et al., 1961; Moore, Hurlbert, 1966; Brown, Reichard, 1969; Kummer et al., 1978). ЭтОт фермент ответствен за восстановление всех четырех рибонуклеозиддифосфатов (rNDP) до соответствующих дезоксирибонуклеозиддифосфатов (dNDP), он служит мишенью сложного аллостерического контроля, который наиболее полно изучен на примере бактериального фермента. Большинство исследований фермента млекопитающих показали его сходство с бактериальным ферментом, однако в последнее время появились указания на то (Peterson, Moore, 1976; Cory et al., 1976), что в клетках млекопитающих существуют два фермента, катализирующих восстановление различных субстратов.

dTTP требуется в качестве аллостерического активатора для восстановления GDP, a dGTP в свою очередь представляет собой аллостерический активатор восстановления АТР. Вместе с тем dTTP является аллостерическим ингибитором восстановления CDP и UDP, a dATP оказывается аллостерическим ингибитором восстановления всех четырех нуклеотиддифосфатов

(NDP). Предполагается, что эта сложная система контролирует сбалансированную поставку дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) для синтеза ДНК. Поскольку восстановление UDP и CDP лежит на пути биосинтеза dTTP, то контроль на этих этапах не представляется неожиданным (рис. 11.3), и синтез ДНК

Рис. 11.3. Взаимопревращения дезоксирибонуклеотидов.

подавляется высокими концентрациями dTTP, снижающими образование dCTP. Помимо удаления ингибиторных концентраций тимидина из культуральной среды, блок синтеза ДНК может быть также снят добавлением дезоксицитидина в концентрации 10 мкМ (Morris, Ficher, 1960; Bjursell, Reichard, 1973).

11.8.4. Действие гидроксимочевины

Гидроксимочевина подавляет синтез ДНК также благодаря действию на рибонуклеотидредуктазу, но в этом случае снижается пул пуриновых рибонуклеотиддифосфатов, а пул dTTP слегка увеличивается (Turner et al., 1966; Adams, Lindsay, 1967; Kra-koff et al., 1968; Adams et al., 1971; Skoog, Bjursell, 1974). Смена среды не приводит к полному обращению действия гидроксимочевины.

11.9. Индукции синхронизации на границе фаз G1IS

11.9.1. Голодание по изолейцину и гидроксимочевина

— Посеять 7,5-10⁵ промытых клеток СНО в чашки диаметром 5 см в МСИ, лишенной изолейцина и содержащей 5% диа-лизованной сыворотки эмбриона крупного рогатого скота.

— После 8 ч инкубации сменить среду на МСИ с изолейцином, 10% недиализованной сыворотки эмбриона крупного рогатого скота и 2 мМ гидроксимочевиной.

— После 16 ч вновь сменить среду на полную среду без гидроксимочевины. Большинство клеток оказываются при этом на

границе фаз G1/S и немедленно начинают синтез ДНК- Это может быть прослежено радиоавтографически, по общему включению ³Н-тимидина, или позднее по появлению митотических клеток.

11.9.2. Клетки в стационарной фазе и аминоптерин

— Установить культуру мышиных клеток L929 в бутылях Ру в среде Игла (модификация Глазго) с 10% сыворотки теленка.

— Менять среду каждые два дня.

— На 8-й день снять клетки трипсинизацией и посеять по 4-10⁵ клеток в чашки диаметром 5 см в той же среде, в которую добавлены аминоптерин (2 мкМ), аденозин (200мкМ) и глицин (100 мкМ).

— Через 16 ч снять блок добавлением тимидина (2«10^_5М) и дезоксицитидина (2*10^-6М), после чего клетки начинают синтезировать ДНК, вначале медленно, но через 3 ч с максимальной скоростью.

11.9.3. Двойной тимидиновый блок

— Посеять по 3-10⁵ клеток HeLa в чашки диаметром 5 см в среде Игла (модификация Глазго) с 10% сыворотки теленка и 3 мМ тимидином.

— После 16 ч сменить среду на свежую без тимидина.

— Через 8 ч добавить тимидин до конечной концентрации 3 мМ.

— После следующих 16 ч повторить вторую стадию, что приведет к синхронному вступлению клеток в фазу S.

11.9.4. Сравнение методов

Метод двойного тимидинового блока наиболее широко распространен в экспериментальных исследованиях, но он утомителен и имеет еще и тот недостаток, что вступление клеток в фазу S в течение первого часа или около того сопровождается снижением пула dTTP, что затрудняет оценку скорости синтеза ДНК.

Метод с изолейцином/гидроксимочевиной также включает в себя две смены среды, но первая из них может быть просто заменена добавлением изолейцина в неполную среду.

Метод с аминоптерином и клетками в стационарной фазе имеет тот недостаток, что для подготовки клеток требуется целая неделя, хотя последующие манипуляции очень просты.

Возможны, естественно, изменения и другие комбинации этих методов, например: отбор митотических клеток и тимидиновый блок, аминоптериновый блок, снимаемый низкими концентра-

циями тимидина, за которым следует тимидиновый блок, обращаемый дезоксицитидином.

Все эти методы обеспечивают накопление 80—90% клеток на границе фаз G1/S и весьма удобны для исследования популяций клеток, находящихся в фазе S. Они легко применимы для проведения крупномасштабных экспериментов, вплоть до уровня вращающихся бутылей, но при таком масштабе применение двойного тимидинового блока требует значительного расхода тимидина. Можно использовать концентрированные растворы тимидина, стерилизованные автоклавированием, но большинство других растворов должны быть стерилизованы фильтрованием.

11.10. Синхронизация в фазе <32

Фазу G2 клеточного цикла исследовать, по-видимому, труднее всего, поскольку наиболее трудно получить популяцию клеток, синхронизированных в фазе G2. Дело в том,», что если клетки синхронизированы путем отбора митотических клеток или накоплением на границе фаз G1/S, то при достижении ими фазы G2 степень синхронизации заметно снижается. Это происходит в результате дисперсии скоростей, с которыми индивидуальные клетки проходят клеточный цикл. Популяции клеток в фазе G2 всегда содержат клетки, находящиеся в других фазах клеточного цикла, и максимальное обогащение клеток китайского хомячка СНО, находящихся в фазе G2, оказывается 0,7 в случае двойного тимидинового блока и 0,4 в случае отбора митотических клеток (Enger et al., 1968).

Популяции культивируемых клеток останавливаются в фазе G1, т. е. между клеточными делениями и началом синтеза ДНК. Есть указания, что часть эпидермальных клеток уха мыши задерживается в фазе G2 (Gelfant, 1959, 1963), хотя результаты более поздних исследований не подтвердили этого вывода (Sauerborn et al., 1978). Сообщалось, что эмбриональные фиб-робласты человека, поддерживаемые в культуре в течение 48 пассажей, т. е. на терминальной стадии, могут быть остановлены в фазе G2 (Maciero-Coelho et al., 1966), но такие клетки столь аномальны, что не могут быть использованы для изучения фазы G2.

Один из путей получения популяции клеток в фазе G2 — это получение мутантных линий с температурочувствительной стадией в фазе G2; метод отбора таких температурочувствитель-ных мутантов известен (Basilico, 1978).