Методы культуры клеток для биохимиков R. L. P. Adams

Клеточные культуры — наиболее широко используемое и незаменимое средство для получения и культивирования вирусов. Хотя некоторые вирусы проще получать из животных или из куриных эмбрионов, но началом современной эры вирусологии следует считать работу Эндерса и др. (Enders et al., 1949), которые показали, что вирусы полиомы могут размножаться в различных типах культивируемых клеток человека, тогда как их размножение in vivo ограничивается главным образом нейронами серого вещества спинного мозга.

В настоящее время для выделения и размножения вирусов животных используются первичные культуры, штаммы клеток и установившиеся клеточные линии. В общих чертах процедура оказывается одинаковой для всех вирусов: комбинации клеток.

Среду удаляют с клеточного монослоя и монослой промывают СБСР или ФСБ (приложение 1) для удаления ингибиторов (антител), которые могут присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируются в небольшом количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30—60 мин. После этого солевые растворы заменяются свежей средой.

Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает характерные морфологические изменения клеток. Конечные дегенеративные клеточные процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказываются различными в случае разных вирусов.

Если вместо продуктивной инфекции вирус вызывает клеточную трансформацию, то это также сопровождается характерными изменениями морфологии и особенностей роста клеток. Более подробно это рассматривается в разд. 14.4.

Для более подробного ознакомления с вирусами животных следует обратиться к соответствующей монографии (Fenner et al., 1974).

14.1.1. Классификация вирусов животных

В классификации, приведенной в табл. 14.1, представлено 16 групп вирусов животных. В основе этой классификации лежат: а) природа нуклеиновых кислот вирусов, б) структурная

симметрия вирусных частиц, в) наличие оболочки и г) размер вирионов. Классификация упрощена по сравнению с классификацией Френкель-Конрата (Fraenkel-Conrat, 1974) и напоминает классификацию Вилди (Wildy, 1971), но отличается от последней в деталях, поскольку точная таксономическая взаимосвязь не рассматривается.

14.1.2. Предосторожности при работе с зараженными вирусами клетками

Вирусы оказывают цитопатогенное действие и служат этиологическими агентами при многих заболеваниях человека и животных. Кроме того, многие вирусы (например, онкорнавирусы, вирус герпеса тип II, аденовирусы, вирус полиомы и SV40) являются, по-видимому, агентами, вызывающими развитие опухолей у животных. Из-за способности вирусов проходить через бактериальные фильтры бывает трудно исключить вирусы из культур незараженных клеток при наличии вирусных суспензий, когда возможна передача вируса через воздух культуральной комнаты.

Указанные ниже меры предосторожности носят самый общий характер и применимы только в тех случаях, когда вирусы не представляют какой-либо особой опасности, т. е. в случае вирусов, не перечисленных в списке Годбера опасных патогенов (Godber, 1975). При использовании особо опасных вирусов следует применять дополнительные меры предосторожности, и ис-следователь^должен обратиться к вышеупомянутому списку / Годбера, в котором приведены правила лабораторного использования патогенов категории А, т. е. вирусов, представляющих опасность для здоровья сотрудников Лаборатории или людей и животных окружающего мира. Материал, содержащий живые организмы этой категории, не может быть использован в лабораториях Соединенного Королевства без специального разрешения властей. К вирусам, представляющим особую опасность, относятся вирусы ньюкаслской болезни, вирусы ящура, вирусы везикулярного стоматита, вирусы оспы, вирусы бешенства, вирусы герпеса типа В и так далее. Кроме того, нельзя быть уверенным, что даже такие вирусы, как SV40, не представляют опасности для человека, и в монографии, опубликованной лабораториями Колд-Спринг-Харбора (Hellman et al., 1973), рассмотрены различные патологические последствия, которые могут возникать в биологических лабораториях.

— Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна использоваться специальная комната или группа комнат.

— Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся

Таблица 14.1

Классификация вирусов животных¹>

Группа	Нуклеиновая кислота	Средняя нол. мае-, са 10«	Диаметр вирио-на, им	Форма	Симметрия	(+) оболочка	Пример
Парвовирусы	ДНК оц	2	20	Сферическая	Икосаэдр	—	МВМ
Паповавирусы	ДНК дц	3—5	45-55	>		—	SV40
Аденовирусы	ДНК дц	20—25	70—80			■—	Ad 2
Герпесвирусы	ДНК дц	54—92	100—150	Примерно сферическая	»		ВГП
Вирусы группы оспы	ДНК дц	160—200	300x240x100	Кирпичеобраз-ная	Сложная	+	Вирус осповак-цины
Пикорнавирусы	РНК оц	—2	20-30	Сферическая	Икосаэдр	—	Полиовирус
Тога- или энцефаловирусы	РНК оц	2—3	50—70	>	Куб	+	Вирус Синдбис
(Орто) миксовирусы	РНК оц	~3	80—120	Примерно сферическая	Спираль	+	Вирус гриппа
Коронавирусы	РНК оц	~3	80—120	То же	»		Вирус мышиного гепатита
Пар а миксовирусы	РНК оц	7,5	100—300	Плейоморфная	Спираль		ВНБ
Рабдовирусы	РНК оц	6	175x75	Пулевидная	>		ВВС
Аренавирусы	РНК оц		85—120	Примерно сферическая	»		Вирус Лаоса
Лейковирусы (онкорна или	РНК оц	10—12	100—120	То же	Сложная	+	ВСР
ретро)	РНК оц
Реовирусы	РНК дц	10	70—90	Сферическая	Икосаэдр		Реовирус

') Данная классификация предложена Френкель-Конратом (Fraenkel-Conrat, 1974). «оц» и «дц» обозначают соответственно одмоцепочечную и двухцепйчечную нуклеиновые кислоты. (±) обозначает наличие или отсутствие оболочки вируса. Сокращенные обозначеиия вирусов приведены в приложении 6.

контейнеры. Следует принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих контейнеров не были загрязнены вирусными частицами.

— При работе с вирусами должны быть использованы специальные защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования (Sterilin Ltd.; приложение 3).

— Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом (разд. 4.1.1); только после этого их можно выносить из помещения, предназначенного для работы с вирусами.

— Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специальный бак для автоклавирования (Sterilin Ltd., приложение 3).

— Оборудование для хранения и обработки вирусного материала должно размещаться внутри помещения для работы с вирусами.

— Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми автоклавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

14.2. Получение вирусов

Для изучения кривой роста вирусов проводится одноэтапный цикл роста. Применяется высокая множественность заражения .(МЖ), чтобы быть уверенным в заражении всех клеток. Обычно бывает достаточным применять 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку. Для получения вирусов фазу инфицирования удлиняют в условиях, обеспечивающих вторичное заражение; в этом случае рекомендуется низкая МЖ, особенно когда имеет место тенденция к образованию дефектных вирусных частиц.

14.2.1. Процедура получения вируса герпеса простого, вируса псевдобешенства или вируса энцефаломиокардита

— В 12 вращающихся бутылей Винчестер посеять по 2-10⁷ клеток ВНКС13 в МСИТС (минимальная среда Игла с 10% триптозофосфатного бульона и 10% сыворотки теленка) и выращивать при 37°С в течение 3 дней.

— Инфицировать каждую культуру вирусом (20 мл) в среде Игла, не содержащей сыворотки при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток.

— Инкубировать при 37 °С в течение 1 ч для адсорбции вируса клетками. "Добавить 50 мл среды Игла с 5% триптозо-фосфата и 5% сыворотки теленка и инкубировать при 37°С

в течение 2 дней или при 32 °С в течение 3 дней (для вируса герпеса простого), в течение 27—36 ч (для вируса псевдобешенства) и в течение 24 ч (для вируса энцефаломиокарди-та). При подкислении среды следует через сутки добавить бикарбонат.

— Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослой версеном, но НЕ трипсином.

— Осадить клетки центрифугированием при 400g в течение 10 мин.

— Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20 000g (lOOOOOg в случае вируса энцефаломиокардита) в течение 90 мин. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлороса, а осадок суспендировать в МСИ с 10% триптозофосфата и 5% сыворотки теленка (приложение I) (2 мл на бутыль). Аликвоты суспензии разлить по маленьким бутылям и хранить при —-70 °С (ВИРУС, АССОЦИИРОВАННЫЙ С НАДОСАДОЧНОИ ФРАКЦИЕЙ).

— Образовавшие осадок клетки разрушить озвучиванием или тремя циклами замораживания и оттаивания в бане лед/этанол. Осадить обломки клеток при 400g в течение 10 мин и аликвоты надосадочной фракции хранить при —70°С (ВИРУС, АССОЦИИРОВАННЫЙ С КЛЕТКАМИ).

— Оба препарата вирусов проверить на бактериальное загрязнение (гл. 9), инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37 °С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37 °С) (приложение 4). Вирусы из хранящихся препаратов можно очищать седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг или RbCl (Black et al., 1964). В этих условиях выявляются полосы, соответствующие ви-рионам и пустым частицам.

14.2.2. Процедура для получения вируса SV40

а. В 20—30 чашках диаметром 9 см высеять по 2-Ю⁶ клеток BSC1 в среде МСИС (среда Игла с 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота).

б. После 1—2 дней роста заразить клетки вирусом с множественностью заражения 0,01 БОЕ на клетку. Предпочтительно использовать вирус, выделенный из бляшек (см. разд. 14.3.1), чтобы избежать примесей дефектных вирионов.

в. После роста в течение недели—10 дней (т. е. когда в большинстве клеток проявляется сильный цитопатический эффект) соскрести клетки в среду. Выдержать клетки при 4°С в течение 1 ч и затем центрифугировать, при 15 000g в течение 30 мин.

г. Ресуспендировать клетки в 20 мл ФСБ-А и добавить панкреатическую ДНК-азу I (40 мкг/мл) и панкреатическую РНК-азу (12 мкг/мл).

д. Разрушить клетки тремя циклами замораживания — оттаивания или озвучиванием и инкубировать 30 мин при 37°С.

е. Добавить дезоксихолат до концентрации 0,15% и выдержать при комнатной температуре в течение 90 мин. Центрифугировать при 15000g в течение 30 мин при 20 °С.

ж. Перенести надосадочную фракцию в пробирки ротора SW27 центрифуги Спинко, в которые предварительно внесено по 10 мл насыщенного раствора КВг в ФСБ-Д. Центрифугировать при 23 000 об/мин в течение 3 ч при 20 °С. После этого в растворе КВг обнаруживаются две полрсы: нижняя, содержащая вирионы, и верхняя, содержащая пустые частицы.

з. Проколов пробирки, собрать полосы с вирионами и диали-зовать их против ФСБ-А (2 раза по 1 часу).

и. Добавить твердый СвСГ"ДО плотности 1,34 г/мл и центрифугировать аликвоты по 3 мл, покрытые сверху слоем парафинового масла в роторе Спинко SW50.1 при 40 000 об/мин и 20 °С в течение 18 ч. Вирионы оказываются в зоне частиц с плавучей плотностью 1,34 г/мл.

к. Собирать фракции, оценивая плавучую плотность (по индексу преломления) и поглощение ультрафиолетового света при 260 и 280 нм для выявления вирионов и пустых частиц (последние характеризуются относительно низким поглощением при 260 нм).

л. Объединить фракции, содержащие вирионы, и диализировать

против ФСБ при 4°С в течение 2 ч. м. Стерилизовать пропусканием через фильтр с диаметром пор

0,22 мкм, если вирусы нужны для последующей инфекции.

Хотя эта процедура необходима для получения препаратов чистых вирионов, она, как правило, не используется при получении инфекционных вирусов. В последнем случае клетки собираются асептически и обрабатываются вплоть до этапа «д», но без использования ДНК-азы и РНК-азы. Клеточные обломки удаляются центрифугированием при 15 000g в течение 30 мин, а надосадочную фракцию используют в качестве источника вируса. Эта надосадочная фракция должна быть тестирована на бактериальное загрязнение в бульоне с экстрактом сердца и мозга и в жидкой среде Саборада (приложение 4). Вирус должен храниться при — 70 °С в концентрации 10¹⁰ БОЕ/мл.

14.2.3. Одноэтапный рост SV40

Этот процесс можно изучать в чашках диаметром 9 см или в лунках пластинок для культуры тканей.

— Высеять 2-10^е клеток (чашки диаметром 9 см) или 10⁵ кле-

ток (лунки пластинок для культуры тканей) соответственно в 10 мл или 0,5 мл среды Игла, содержащей заменимые аминокислоты, пенициллин со стрептомицином и 10% сыворотки эмбриона крупного рогатого скота (приложение 1). — Через 1—2 дня роста сменить среду и добавить SV40 со множественностью заражения 1 БОЕ/клетка (2 мл на чашку или 0,1 мл на лунку.).

Время после инфицирования, ч

Рис. 14.1. Динамика инфицирования вирусом SV40. Клетки обезьяны в моно-слойной культуре заражали вирусом SV40 при множественности 1—10 БОЕ на клетку. Т-антиген может быть обнаружен с помощью иммунофлуоресцен-ции, синтез вирусной ДНК — по включению ³Н-тимидина с последующим отделением вирусной ДНК (путем экстракции по Херту и центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы или электрофореза в агарозе в присутствии до-децилсульфата натрия). Зрелые вирионы выявляли по инфекционности с использованием тоста на бляшки. [Данные из (Tooze, 1973; Girard et al., 1975;

Basilico, Zouzias, 1976).]

— Инкубировать при 37 °C в течение 60—90 мин для адсорбции вируса клетками и добавить среду Игла, содержащую 5% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (8 мл на чашку и 0,4 мл на лунку).

Синтез ДНК достигает максимума на 2-й день после заражения. Он может быть обнаружен и на первый день; ему соответствует или слегка предшествует образование Т-антиге-на. Зрелые вирионы обнаруживаются после короткого лаг-периода (рис. 14.1).

14.2.4. Вирус Сендай — получение и инактивация 14.2.4.1. Получение

Вирус Сендай выращивается в аллантоисной полости куриных яиц. Метод выращивания описан Харрисом и Уоткинсом (Harris, Watkins, 1965).

— Получить зараженную аллантоисную жидкость, содержащую

вирус Сендай в концентрации 8000 ГАЕ/мл и развести ее ФСБ в соотношении 1 : 10⁴.

— Инъецировать 0,1 мл в аллантоисную полость куриных яиц на 10—11-й день после оплодотворения.

— Инкубировать в течение 3 суток при 37 °С и затем в течение ночи при 4 °С.

— Собрать аллантоисную жидкость и центрифугировать при 400 g в течение 10 мин.

— Определить титр гемагглютинации (разд. 14.3.3).

— Центрифугировать при 30 000g в течение 30 мин и суспендировать осадок в 1/10 исходного объема СБСР Хэнкса.

— Хранить при —70 °С.

14.2.4.2. Инактивация ультрафиолетом . _t.

— Поместить 1 мл концентрированной суспензии вирусов в часовое стекло и выдержать 3 мин под УФ-светом от герми-цидной лампы 15 Вт (мощность дозы облучения 3000 эрг/см*/ /сек). Перемешивать суспензию через 1 и 2 мин облучения.

14.2.4.3. Инактивация $-пропиолактоном (Neff, Enders, 1968)

— Приготовить 10%-ный водный раствор р-пропиолактона не*-' посредственно перед использованием. ^:'

— Разбавить до 1,3% изотоническим солевым раствором, содержащим 1,68% ЫаНСОз-

— Добавить 1 часть разведенного раствора р-пропиолактона к 9 частям суспензии вируса Сендай (титр гемагглютинадин между 1 :2000 и 1 : 10000) (разд. 14.3.3). ..<

— Встряхивать в тщательно закупоренном контейнере при 4,°(J, в течение 10 мин и затем выдержать при 37°С в.течение 2 ч, встряхивая каждые 10 мин. ... _Vi

— Хранить в течение ночи при 4°С для обеспечения полного,, гидролиза р-пропиолактона. . _:А

— Инактивированный вирус можно сохранять в присутствии 0,5%-ного сывороточного альбумина при —65°С в течение 5 недель.

14.3. Обнаружение вирусов

Можно обнаружить присутствие вирусов, а иногда и определить их количество с помощью целого ряда различных тестов, как, например:

а) индукция характерных изменений в клетках, которые могут¹ быть использованы в анализе на бляшки (см. ниже);

б) образование зараженными клетками вирусных частиц, которые могут быть идентифицированы с помощью классифи-

кации, предложенной в табл. 14.1, — например, по природе нуклеиновых кислот и симметрии частиц;

в) образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при центрифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы (Kaplan, 1969; Tegtmeyer, 1972);

г) образование зараженными клетками или трансформированными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема (Deibel, Hotchin, 1961);

д) наличие антигенов на вирусных частицах .может приводить к реакциям гемагглютинации, позволяющим проводить количественную оценку (разд. 14.3.3);

е) образование зараженными клетками характерных ферментов, или ферментов, легко отличаемых по свойствам от соответствующих ферментов клеток-хозяев (Keir et al., 1966; Baltimore, Smoler, 1971; Harada et al., 1975).

Ниже приведено описание некоторых тестов. Поскольку выбор возможных вирусов и тестов бесконечен, то автор остановился только на тех, с которыми он наиболее знаком.

14.3.1. Метод подсчета бляшек

В основе метода лежит заражение небольшого числа клеток в полном монослое. Вирус, образующийся в зараженных клетках, распространяется вертикально, заражая соседние клетки; известны различные способы предотвращения дальнейшего распространения вируса. Дегенеративный эффект вирусов на клетки распространяется до тех пор, пока не обнаруживается видимая область погибших клеток (бляшка). Окрашивание клеточного пласта позволяет легко визуализировать бесцветные бляшки.

Обычно клеточные культуры заражают препаратами вируса в различном разведении, покрывающем диапазон 10*. Поэтому сток вирусов разводится в 10-кратном объеме.

14.3.1.1. Разведение вирусов

Приготовить серию пробирок, содержащих по 0,9 мл СБСР или ФСБ или среды Игла без сыворотки, и в первую пробирку внести 0,1 мл суспензии вирусных частиц из стока. Перемешать содержимое пробирки и 0,1 мл перенести в следующую пробир-

ку и так далее. Исходная суспензия должна содержать 200— 400 инфекционных единиц в 1 мл, а тестируются обычно разведения в диапазоне Ю^-5—10~⁹.

14.3.1.2. Суспензионный тест

Вирусы герпеса и псевдобешенства могут заражать клетки ВНКС13 в суспензии.

а. Приготовить клеточную суспензию, содержащую 3-Ю⁶ клеток в 1 мл.

б. Добавить по 4 мл клеточной суспензии в каждый из 5 универсальных флаконов.

в. Добавить по 0,8 мл суспензий вирусов в различном разведении в каждый флакон.

г. Перемешать на медленной механической мешалке при 37 °С в течение 20 мин.

д. Через 20 мин добавить в каждый флакон по 12 мл среды Игла с 10% триптозофосфатного бульона и 10% сыворотки теленка (для вируса псевдобешенства) или среды Игла с 10% триптозофосфата и 5% сыворотки человека (для вируса герпеса).

е. Перемешать и посеять по 4 мл в чашки Петри диаметром 5 мм.

ж. Инкубировать в продуваемом СОг термостате при 37 °С. Через 2 ч добавить в культуры с вирусом псевдобешенства по 25 мкл раствора гепарина 10 мг/мл.

з. Через 24 ч (вирус псевдобешенства) или 48 ч (вирус герпеса) слить среду из чашек в раствор хлороса.

и. Фиксировать зараженный монослой 10%-ным формолом в физиологическом растворе в течение 10—20 мин.

к. Удалить фиксирующий раствор и окрасить по Гимза в течение 10—20 мин.

л. Осторожно отмыть избыток красителя проточной водой и подсчитать число бляшек, используя микроскоп с малым увеличением.

14.3.1.3. Тест в монослое

Для вирусов герпеса и псевдобешенства этот тест аналогичен суспензионному тесту, но заражение происходит в полном монослое (рис. 14.2).

— Посеять в 20 чашек (диаметр 50 мм) по 3-Ю⁶, клеток ВНКС13. Выращивать при 37°С в течение 24 ч.

— Удалить среду и внести по 0,2 мл каждого разведения вируса в каждую из 4 чашек (включая контрольные чашки, в которые вносится по 0,2 мл СБСР).

— Дать вирусу адсорбироваться в течение 1 ч при 37 °С, ис-

Рис. 14.2. Бляшки вируса простого герпеса на слое клеток ВНК/С13. Полный монослой клеток BHK21/G13 заражали препаратами вируса простого герпеса (тип 2) в различном разведении. Слева количество бляшек невелико, но

в правой чаше бляшек много.

пользуя продуваемый СОг термостат. Время от времени покачивать чашки для равномерного распределения вирусных частиц над поверхностью.

— Через 1 ч добавить по 5 мл среды Игла с 10% триптозофос-фатного бульона и 10% сыворотки теленка (для вируса псевдобешенства) или 5% сыворотки человека (для вируса герпеса) и вернуть чашки в термостат.

— Через 2 ч добавить гепарин в культуры, зараженные вирусом псевдобешенства.

— Дальнейшая обработка, как в случае суспензионного теста (этапы «з» — «л»).

14.3.1.4. Тест с наслаиванием агара

— В 20 чашек диаметром 50 мм посеять по 2-10⁶—4-Ю⁶ клеток ВНК21/СЗ для вируса энцефаломиокардита или клеток BSC1 для вируса SV40 и выращивать 24 ч при 37 °С до получения полного монослоя.

— Удалить Среду и внести по 0,2 мл вирусной суспензии каждого разведения в каждые 4 чашки (в контрольные чашки внести по 0,2 мл СБСР).

— Дать вирусам адсорбироваться в течение 1 ч при 37°С в продуваемом СОг термостате. Время от времени покачивать чашки для равномерного распределения вирусных частиц над монослоем.

— После адсорбции на каждый монослой клеток наслоить по

5 мл агаровой среды, приготавливаемой следующим образом:

и уравновесить смесь при 46 °С. Важно поддерживать температуру смеси между 45 и 50 °С. Агар застывает вскоре после нанесения на клетки при 37 °С.

— Инкубировать при 37 °С в течение 24 ч (вирус энцефаломиокардита) или 6 дней (вирус SV40).

— Добавить в каждую чашку по 2 мл покрывающей среды с нейтральным красным (см. ниже) и дать ей затвердеть в полной темноте.

— Вернуть в термостат на 2—3 ч (или даже на несколько дней, если бляшки слишком малы для подсчета).

— Выявить образующиеся бляшки и подсчитать их количество с помощью микроскопа с низким увеличением или с помощью счетчика колоний.

Для приготовления 2,5%-ного агара. Noble (Difco Labs.) добавить 25 г агарового порошка в 500 мл дистиллированной воды и довести объем до 1 л. Поместить сосуд в кастрюлю с кипящей водой до полного растворения агара. Разлить по 25 мл в универсальные флаконы с металлическими крышками и ав-токлавировать при давлении 1 атм в течение 15 мин. Хранить при комнатной температуре.

Для приготовления покрывающей среды с нейтральным красным растворить нейтральный красный до концентрации 0,4% в дистиллированной воде (в случае необходимости с нагреванием) и профильтровать через бумажный фильтр Грина № 9041/2 (приложение 3). Разлить в бутыли по 20 мл и стерилизовать автоклавированием при давлении 1 атм в течение 15 мин. Хранить при комнатной температуре. Для получения покрывающей среды добавить 2,5 мл раствора красителя к 75 мл среды ИглаX 1,3 и 25 мл 2,5%-ного агара.

¹ МСИ должна быть взята в концентрации, в 1,3 раза превышающей нормальную (среда ИглаХ 1)3).

14.3.2. Метод флуоресцирующих антител

В прямом методе антитела, полученные к вирусным антигенам, сочетаются с флуорохромом и используются для окраски зараженных клеток. Положительная реакция (желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе) указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов. Этот метод, следовательно, может быть использован для выявления клеточной трансформации, когда антитела вырабатываются, например, против ранних антигенов вируса SV40, или для выявления образования зрелых вирусов, когда получаются антитела против капсидных белков.

В непрямом методе антитела не сочетаются с флуорохромом. Вместо этого после взаимодействия антител с антигенами в фиксированных препаратах клеток к ним добавляются анти-гамма-глобулиновые антитела, конъюгированные с флуорохромом. Этот метод более чувствителен и позволяет избежать конъюгации каждого индивидуального антитела с флуоресцентным красителем. Так, одни и те же флуоресцентные антитела к антителам кролика (полученные у овец против кроличьих гамма-глобулинов) могут быть использованы для окраски любых антител, образующихся у кроликов и взаимодействующих с вирусными антигенами в продуктивно зараженных или трансформированных клетках.

Еще более непрямой, но значительно более чувствительный метод, не требующий использования флуоресцентного микроскопа, был предложен Стернбергером (Sternberger et al., 1970) и известен под названием пероксидазный — антипероксидазный метод. Согласно этому методу, кроличьи антитела взаимодействуют с антигенами фиксированных клеток и затем покрываются антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгиро-ванными с комплексами пероксидазы хрена и кроличьей анти-пероксидазы. После этого препараты обрабатывают диамино-бензидином и перекисью водорода; коричневая окраска указывает на присутствие антигенов.

Применимость различных систем рассматривается в работе Тэйлора (Taylor, 1978), в которой можно найти детали имму-нопероксидазного метода.

14.3.2.1. Получение антисыворотки

Инъекция животных клеток или клеточных экстрактов вызывает образование антител. Более подробно этот метод рассматривается в монографии Клаузена (Clausen, 1969), принадлежащей к той же серии, что и настоящее издание. К животным, используемым обычно для получения антисывороток, относятся кролики, мыши, хомячки и т. д. Антисыворотку к вирусным ан-

тигенам лучше получать от сингенных хозяев (т. е. от хозяев с тем же генотипом, что и клетки, в которых вирус рос in vitro). Так, инъекция сирийским хомячкам клеток SV28 (трансформированные SV40 клетки ВНК21/С13) приводит к образованию опухолей и накоплению антител к Т-антигену в сыворотке животных.

14.3.2.2. Получение глобулиновой фракции

Обычно используется грубое фракционирование антисыворотки, приводящее к удалению альбумина. К сыворотке при 4°С медленно добавляют равный объем насыщенного холодного раствора сульфата аммония (рН доводят до 7 с помощью аммиака) и смесь далее перемешивают в течение 30 мин либо сыворотку диализуют при 4°С в течение ночи против 50 объемов сульфата аммония при 50%-ном насыщении.

Осаждаемый сульфатом аммония белок собирают центрифугированием (1200 g в течение 20 мин при 4°С), растворяют в ФСБ-А и три раза диализуют против 50-кратного объема ФСБ-А для удаления сульфата аммония. Подробности очистки и характеристики сывороток приведены в вышеупомянутой монографии Клаузена (Clausen, 1969).

Антисыворотка к гамма-глобулинам различных животных может быть получена таким же образом, но можно пользоваться препаратами из коммерческих источников, например Flow Laboratories (приложение 3).

14.3.2.3. Конъюгация антисыворотки с флуоресцеином или родамином

Это два распространенных флуорохрома, и для ковалентного связывания с белками используются их активированные формы, например изотиоцианаты. Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) и тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) поставляются фирмами, например Sigma Chemical Со. (приложение 3).

Реакция получается более воспроизводимой, если использовать изотиоцианаты, адсорбированные на целите. Комплексы ФИТЦ-целит также поставляются Sigma Chemical Co., но могут быть приготовлены самими исследователями:

а) растворить 25 мг ФИТЦ в 25 мл ацетона;

б) добавить 500 мг целита и перемешивать несколько минут при комнатной температуре;

в) удалить ацетон под вакуумом и хранить в сухом виде в эксикаторе.

— Смешать 0,5 мл глобулиновой фракции с равным объемом карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,3 (4,4 мл 5,3%-ного карбоната натрия и 100 мл 4,2%-ного бикарбоната натрия).

Добавить 15 мг ФИТЦ-целита и плотно закупорить, чтобы избежать потери СОг. Осторожно помешивать в течение 30 мин при комнатной температуре. — Удалить целит центрифугированием (800 g, 10 мин) и отделить конъюгированный белок от избытка красителя на колонке с сефадексом G-25 (1X10 см), проводя элюцию ФСБ-А.

Антисыворотки и конъюгированные антисыворотки могут храниться при —20 или 4°С в присутствии мертиолата (1 часть на 10 000 частей), который действует как консервант.

14.3.2.4. Техника окрашивания Прямой метод

а. Вырастить клетки на покровных стеклах и заразить вирусом (например, SV40).

б. Удалить покровные стекла из зараженных и контрольных культур и, удерживая их корнцангом или поместив в микродержатель для покровных стекол, окунуть в две смены ФСБ-А при комнатной температуре и высушить двумя сменами ацетона при 0°С. Высушить стекла на воздухе на фильтровальной бумаге клетками наверх. Принять меры для идентификации индивидуальных покровных стекол по их положению.

в. Поместить покровные стекла в чашки диаметром 5 см, содержащие влажную фильтровальную бумагу. Часто применяется установка стекол на маленькие резиновые пробки.

г. Покрыть каждое стекло двумя каплями конъюгированной с ФИТЦ антисыворотки хомячка к Т-антигену вируса SV40

■ (разд. 14.3.2). Накрыть чашку крышкой и оставить при комнатной температуре на 45 мин.

д. Промыть покровные стекла тремя сменами ФСБ-А и смонтировать на предметном стекле клетками вниз, используя глицерин в качестве заключающей среды.

Непрямой метод

Повторить этапы «а» — «г» описанного выше прямого метода.

г'. Покрыть каждое покровное стекло двумя каплями неконъю-гированной .антисыворотки хомячка к Т-антигену вируса SV40 (разд. 14.3.2). Накрыть чашки крышками и оставить на 30—45 мин при комнатной температуре.

д'. Промыть покровные стекла тремя сменами ФСБ-А и высушить в течение 10 мин при комнатной температуре. Поместить в новые чашки.

е'. Покрыть каждое покровное стекло двумя каплями конъюги-

рованной с ФИТЦ антисыворотки козы к иммуноглобулинам хомячка. Закрыть крышкой и оставить на 30 мин при комнатной температуре, ж'. Промыть покровные стекла тремя сменами ФСБ-А и смонтировать в глицерине на предметном стекле клетками вниз. Исследовать препараты во флуоресцентном микроскопе.

14.3.3. Гемагглютинация

У многих вирусов имеются антигены, которые могут адсорбироваться на эритроцитах и вызывать их слипание. При взаимодействии большого количества вирусных частиц и эритроцитов образуется сеть клеток, и суспензия агглютинирует, т. е. эритроциты выпадают в осадок. Существует некоторая специфичность, заключающаяся в том, что определенные вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов определенных животных, но если обнаружена активная комбинация, то гемагглютинация становится быстрым тестом, позволяющим определить титр вируса.

Кровь отбирают в гепаринизированный шприц и эритроциты промывают трехразовым переосаждением в 0,85%-ном NaCl при 200 g в течение 10 мин. Окончательный осадок эритроцитов суспендируют в 200-кратном объеме 0,85%-ного раствора NaCl.

Удобнее всего проводить тест на гемагглютинацию в мик-ротитровальных пластинках (рис. 3.2); разнесение аликвот может проводиться вручную или с помощью автоматического оборудования, поставляемого Titertek (Flow Lab. Ltd.) (приложение 3).

В серию лунок микротитровальной пластинки вносят по 25 мкл 0,85%-ного NaCl или ФСБ; в первую лунку вносят 25 мкл суспензии вируса, и смесь перемешивают (разведение 1:2). 25 мкл переносят затем из первой лунки во вторую (разведение 1 :4) и так далее, до конечного разведения 1 :2048. После этого в каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии эритроцитов, смесь перемешивают и оставляют при 4°С, комнатной температуре или 37 °С до наступления гемагглютинации (1-2 ч).

В лунках, где произошла агглютинация, осадок эритроцитов имеет неправильную форму, а в лунках, где гемагглютинации не было, клеточный осадок образует компактную точку на дне лунки. Разведение в последней лунке, в которой происходила гемагглютинация, рассматривается как титр, и этому разведению приписывается значение 1 гемагглютинирующей единицы (ГАЕ). Предшествующее разведение содержит соответственно 2 ГАЕ и так далее.

14.4 Трансформация клеток вирусом

Проникновение вируса в клетку может сопровождаться не продуктивной инфекцией, а трансформацией клеток. Для того чтобы это случилось, весь геном или часть вирусного генома должны встроиться в клеточные хромосомы. Сайт хромосомы, в котором происходит интеграция, не является уникальным, и часто в одной и той же клетке интегрируется несколько копий вирусной ДНК.

У клеток, трансформированных вирусом SV40 или вирусом полиомы, отмечены следующие особенности (Tooze, 1973): Рост: высокая или недостигаемая плотность насыщения, пониженная потребность в сыворотке,

способность к росту в агаре или метилцеллюлозе (приложение б), потеря чувствительности к контактному торможению движения,

образование опухолей при инъекции чувствительным животным,

неориентированный рост, рост на монослое нормальных клеток. Поверхность: увеличение способности к агглютинации растительными лектинами,

выявление плодных антигенов, потери плотных контактов, наличие трансплантационного антигена. Присутствие вируса: присутствие вирус-специфических антигенов,

выявление последовательностей вирусной ДНК, присутствие вирусных мРНК,

возможность в некоторых случаях «спасения» вируса. 14.4.1. Методы трансформации

Известны по крайней мере 4 метода трансформации клеток вирусами.

А. Простейший метод предложили Макферсон и Монтегнир (Macpherson, Montagnier, 1964). Клетки в суспензии заражают -вирусом и высеивают в 0,33%-ный агар или 1,2%-ный Methocel (приложение 6), где трансформированные клетки образуют большие колонии, а ^трансформированные — не растут.

Приготовить базальный слой из 7 мл среды (среда Игла в модификации Глазго с триптозофосфатом и сывороткой теленка) с 0,5% бактоагара Difco в чашках диаметром б см.

Инкубировать суспензию клеток с вирусом в течение 1 ч и добавить (10³—5) -10^s клеток в 1,5 мл среды, содержащей 0,3% агара или 1,2% карбоксиметилцеллюлозы (Stoker, 1968), поверх базального слоя.

Инкубировать 7—10 дней при 37 °С в продуваемом С0₂ термостате; в этих условиях только трансформированные клетки образуют колонии.

Б. Культуру клеток, не достигшую полного монослоя, заразить вирусом и выращивать клетки в течение 2—3 недель, пока на монослое нетрансформированных клеток не вырастут плотные колонии трансформированных клеток.

В. Зараженные вирусами клетки посеять при низкой плотности и низкой концентрации сыворотки. Многие клетки в этих условиях делятся один или два раза (абортивная инфекция), но лишь стабильно трансформированные клетки могут образовывать колонии в отсутствие сывороточных факторов (Smith et al., 1970).

Г. Три первых метода осуществляют отбор трансформированных клеток по тому или иному новому свойству из перечисленных выше. Стокер и Макферсон (Stoker, Macpherson, 1961) заражали вирусом полный монослой и затем высевали клетки при низкой плотности. Затем они отбирали колонии трансформированных клеток по внешним признакам в отсутствие какого-либо давления отбора.

< Клеточные мутанты и гибридные клетки		Дифференцировка в культурах клеток >